CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM
3.1. Địa điểm tiến hành thí nghiệm
- Viện nghiên cứu và phát triển ứng dụng các hợp chất thiên nhiên INAPRO.
3.2. Nguyên liệu, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm
3.2.1. Ngun liệu
Hạt cà phê Robusta S18 được mua tại công ty TNHH TM DV XUẤT NHẬP KHẨU BUÔN MÊ COFFEE (Tháng 1- tháng 3, năm 2018). Hạt cà phê sau khi mua về được bảo quản tại phịng 101 của INAPRO.
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ thí nghiệm
- Bình tam giác thủy tinh 500 ml, 1000 ml. - Cốc có mỏ thủy tinh 50ml, 100ml, 1000ml. - Ống đong 100ml, 250ml, 500ml.
- Đũa thủy tinh. - Lọ đựng mẫu 10ml. - Nhiệt kế.
- Giá kẹp. - Cồn kế.
- Xilanh bơm mẫu (Micropipet). - Pipet 10 ml.
Thiết bị thí nghiệm - Cân khối lượng
1 Precisa 0,01 220 0,001 - Thiết bị khuấy có gia nhiệt (loại hai vỏ).
- Bếp ổn nhiệt. - Bơm nhúng chìm. - Bơm hút chân khơng.
- Máy sắc ký HPLC (SHIMADZU – 10A)
Hình 3.1. Máy sắc ký HPLC
Hóa chất dùng trong phân tích
STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Hãng sản xuất Xuất xứ
1 Etanol 96%V Xilong Trung Quốc
2 Metanol ≥ 99,8% Merck Germany
Tủ lạnh: Ngăn mát 8 -100C. Ngăn đá 00C.
3.3. Các bước tiến hành thí nghiệm
3.3.1. Chuẩn bị mẫu
Hạt cà phê nguyên liệu sau khi được phân loại các hạt hỏng sẽ được nghiền. Khối lượng mỗi mẫu thí nghiệm dùng là 50 g. Mẫu thí nghiệm được đựng trong các túi zip để bảo quản chất lượng.
3.3.2. Đánh giá nguyên liệu
3.3.2.1 Xác định độ ẩm
Cân chính xác 5,00 g mẫu rồi cho vào máy sấy ở nhiệt độ 130oC trong 4 giờ. Sau đó cứ 1 giờ lại cân mẫu, quá trình lặp lại đến khi khối lượng giữa hai lần cân khơng đổi thì dừng. Mẫu được để nguội trong bình hút ẩm, rồi xác định lượng cân. 3.3.2.2 Xác định hàm lượng CGA tối đa trong mẫu [15]
Dùng phương pháp chiết soxhlet, nguyên liệu với dung môi metanol 99% để chiết kiệt CGA ra khỏi nguyên liệu (hình 3.2).
Hình 3.2. Hệ thống thí nghiệm chiết Soxhlet
Cân chính xác 5,0g mẫu, bọc vào giấy lọc rồi đưa vào trụ chiết. Lấy 100ml metanol 99% và vài viên đá bọt vào bình chưng. Dung mơi trong bình chưng được đun sơi bằng phương pháp cách thủy. Hơi metanol liên tục đi lên, vào sinh hàn nước. Tại đây nó được ngưng tụ thành lỏng rồi chảy trở lại trụ chiết làm dung môi chiết. Khi trụ chiết đầy, dịch chiết tự chảy xuống bình chưng. Quá trình này lặp đi lặp lại đến khi thử, định tính giọt chất lỏng ra khỏi trụ chiết khơng cịn CGA thì kết thúc q trình (khoảng 8h). Dịch chiết thu được đem đi đo thể tích, phân tích hàm lượng CGA.
Phương pháp chiết soxhlet tiến hành đã chiết kiệt CGA ra khỏi ngun liệu do đó hàm lượng CGA thu được từ thí nghiệm này được sử dụng làm cơ sở để đánh giá hiệu suất q trình trích ly CGA.
3.3.3. Hệ thống thí nghiệm q trình trích ly CGA
Hình 3.3. Hệ thống thí nghiệm trích ly CGA
Các thiết bị chính:
1. Thiết bị khuấy có gia nhiệt (loại 2 vỏ) 2. Động cơ cánh khuấy
3. Bếp ổn nhiệt 4. Nhiệt kế điện tử 5. Đồng hồ
3.3.4. Sơ đồ tiến hành thí nghiệm
Hình 3.4. Sơ đồ q trình tiến hành thí nghiệm trích ly CGA
Hạt cà phê ban đầu được loại bỏ hạt hỏng rồi được đem đi ghiền nhỏ bằng máy xay. Các mẫu được chuẩn bị là 50g cho vào trong các túi zip.
Hệ thống thí nghiệm được chuẩn bị như phần 3.3.3 sau đó ta cho mẫu cà phê vào trong thiết bị hai vỏ, đưa dung môi vào trong thiết bị với tỉ lệ mình muốn khảo sát. Điều chỉnh nhiệt độ và tính thời gian khảo sát khi nhiệt độ bên trong thiết bị ổn định.
Sau q trình trích ly, ta loại bỏ bã bằng cách sử dụng phễu lọc hút chân không. Dịch chiết được đem đi phân tích hàm lượng CGA và phần cịn lại được bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh. Phần dịch chiết trước khi đem đi phân tích hàm lượng CGA phải được tiến hành qua bước lọc trong.
Hàm lượng CGA được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [14]
3.3.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly CGA
3.3.5.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly CGA sử dụng dung môi etanol
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Các thí nghiệm được thực hiện với nồng độ dung mơi
etanol 50%, thời gian trích ly 60 phút,tỷ lệ dung mơi trên ngun liệu 10 ml/g, nhiệt độ được thay đổi là: 29,5 , 35, 45, 55, 65, 75oC.
- Ảnh hưởng của nồng độ etanol: Các thí nghiệm được thực hiện với thời gian
trích ly 60 phút,tỷ lệ dung mơi trên nguyên liệu 10 ml/g, nhiệt độ phù hợp ( đã được xác định bên trên), nồng độ etanol được thay đổi là: 40, 50, 60, 70, 80, 90% thể tích.
- Ảnh hưởng của thời gian trích ly: Trên cơ sở kết quả khảo sát trên thu được các
điều kiện nhiệt độ, nồng độ etanol thích hợp, tỷ lệ dung mơi trên nguyên liệu 10 ml/g, với thời gian thay đổi là : 30, 60, 90, 120, 150 phút.
3.3.5.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly CGA sử dụng dung mơi là nước.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Các thí nghiệm được thực hiện với tỷ lệ L/R là 12
ml/g, thời gian trích ly 60 phút, nhiệt độ được thay đổi là: 25 , 35, 45, 55, 65, 75oC.
- Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu (L/R): Các thí nghiệm được thực
hiện với thời gian trích ly 60 phút, nhiệt độ phù hợp ( đã được xác định bên trên), tỷ lệ L/R được thay đổi là: 4, 8, 12, 16, 20 (ml/g)
- Ảnh hưởng của thời gian trích ly: Trên cơ sở kết quả khảo sát trên thu được các
điều kiện nhiệt độ, tỷ lệ dung mơi trên ngun liệu (L/R) thích hợp với thời giant hay đổi là : 30, 60, 90, 120, 150 phút.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khảo sát nguyên liệu
Để có cơ sở đánh giá nguyên liệu ta tiến hành xác định các thơng số chính của mẫu như: độ ẩm, hàm lượng CGA có trong mẫu. Thực nghiệm được tiến hành với trên 5g nguyên liệu.
4.1.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu
Để xác định độ ẩm ta chuẩn bị 5g mẫu nguyên liệu sau đó sấy tại 130oC và sau khoảng thời gian nhất định ta tiến hành cân lại mẫu cho đến khối lượng khơng đổi. Kết quả thí nghiệm thu được ở bảng dưới đây:
Bảng 4.1. Bảng kết quả xác định độ ẩm của mẫu
Thời gian (giờ) Khối lượng mẫu (g)
0 5
4 4,51
5 4,46
6 4,43
7 4,43
Từ bảng 4.1 ta xác định được khối lượng ẩm bằng: mẩm = 5 – 4,43 = 0,57 (g) Do vậy độ ẩm tuyệt đối của mẫu là : w=mẩm
4.1.2. Xác định hàm lượng CGA của nguyên liệu
Mục đích của thí nghiệm này là xác định hàm lượng CGA tối đa có trong mẫu cà phê để sử dụng kết quả này làm cơ sở để đánh giá hiệu suất q trình trích ly CGA trong hạt cà phê xanh. Kết quả phân tích HPLC cho thấy :
Khối lượng CGA thu được trên 1 gam mẫu chiết soxhlet là 85,49 (mg)
4.2. Ảnh hưởng của dung mơi etanol đến hiệu suất trích ly CGA
Bảng 4.2. Kết quả thí nghiệm trích ly CGA từ hạt cà phê xanh với dung môi etanol
ST T Khối lượng mẫu Nhiệt độ (T) Nồng độ etanol (C ) Thời gian (t) Hàm lượng CGA thu được
trên 1g mẫu Hiệu suất trích ly CGA (H) (g) (oC) (% thểtích) (phút) (mg) (%) 1 50 29.5 50 60 45,24 52,92 2 50 35 50 60 49,78 58,23 3 50 45 50 60 54,97 64,30 4 50 55 50 60 58,73 68,70 5 50 65 50 60 63,93 74,78 6 50 75 50 60 59,62 69,74 7 50 65 40 60 45,41 53,12 8 50 65 50 60 63,93 74,78 9 50 65 60 60 59,2 69,25 10 50 65 70 60 55,73 65,19 11 50 65 80 60 48,53 56,77 12 50 65 90 60 31,99 37,42
13 50 65 50 30 53,86 63,00
14 50 65 50 60 63,93 74,78
15 50 65 50 90 67,06 78,44
16 50 65 50 120 69,05 80,77
17 50 65 50 150 67,28 78,70
4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất trích ly CGA từ hạt cà phê xanh
25 35 45 55 65 75 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 C = 50% t = 60 phút T, oC H , %
Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly CGA
Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất trích ly CGA
Khảo sát nhiệt độ trong q trình trích ly là cần thiết. Bởi vì nhiệt độ làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của các hợp chất, làm giảm độ nhớt dung môi, tăng khả năng truyền khối và xâm nhập của dung môi vào trong tế bào. Tuy nhiên khơng phải tăng nhiệt độ càng cao thì q trình trích ly càng tốt.
Từ bảng 4.2 và đồ thị 4.1 ta thấy hiệu suất trích ly CGA tăng dần khi ta tăng dần nhiệt độ. Hiệu suất này đạt được cao nhất tại 65 oC là 74,78% và giảm xuống cịn 69,74% khi thực hiện q trình trích ly ở 75oC. Điều này được giải thích là do khi nhiệt độ tăng đến một mức nhất định có thể sẽ làm phân hủy axit clorogenic.
Như vậy có thể chọn nhiệt độ 65oC cho các khảo sát tiếp theo.
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung mơi đến hiệu suất trích ly CGA từ hạt cà phêxanh xanh 40 50 60 70 80 90 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 T = 65 oC t = 60 phút C, % H , %
Ảnh hưởng của nồng độ Etanol đến hiệu suất trích ly CGA
Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung mơi đến hiệu suất trích ly CGA
Từ bảng 4.2 và đồ thị 4.2 ta nhận thấy hiệu suất trích ly CGA lớn nhất khi thực hiện q trình trích ly với nồng độ etanol là 50%. Vậy ta chọn nồng độ C = 50% cho những thí nghiệm tiếp theo.
4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly CGA từ hạt cà phê xanh30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 T = 65oC C = 50% t, phút H , %
Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly CGA
Đồ thị 4.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly CGA
Từ bảng 4.2 và đồ thị 4.3 cho ta thấy khi tăng thời gian trích ly từ 30, 60, 90, 120(phút) thì hiệu suất trích ly CGA tăng dần và đạt cực đại tại 120 phút với hiệu suất là 80,77%. Khi thực hiện q trình trích ly với thời gian 150 phút thì hiệu suất trích ly CGA giảm cịn 78,70%. Kết quả này được giải thích là vì khi tăng thời gian trích ly thì khả năng thu được CGA sẽ tốt hơn nhưng thời gian quá dài sẽ làm cho CGA bị phân hủy.
4.2.4. Thiết lập mơ hình hồi quy q trình trích ly sử dụng dung mơi etanol.
Q trình trích ly chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố nhiệt độ, thời gian, loại dung môi, nồng độ dung môi sử dụng. Các yếu tố khi kết hợp với nhau lại có tác động ít hay nhiều theo từng mức độ khác nhau, do đó để có được điều kiện tối ưu nhất về kinh tế cũng như thời gian chế biến, cần khảo sát mức độ ảnh hưởng này để có thể chọn chế độ thích hợp nhất.
Ba yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly bao gồm: nhiệt độ xử lý (Z1 – oC), thời gian trích ly (Z2 – phút), nồng độ dung môi etanol (Z3 – %thể tích) .
Hàm mục tiêu cần đạt được là hàm lượng CGA thu được tính trên một đơn vị khối lượng mẫu cà phê.
4.2.4.1. Quy hoạch thực nghiệm bậc một
Mức trên, mức dưới và khoảng biến thiên các yếu tố được trình bày ở bảng sau:
Bảng 4.3. Giá trị thực nghiệm và giá trị mã hóa của các yếu tố
Các yếu tố Mức dưới (-1) Mức cơ sở (0) Mức trên (+1) Khoảng biến thiên (Δ) Z1 – oC 55 65 75 10 Z2 – phút 90 120 150 30 Z3 –%thể tích 40 60 50 10
Lập ma trận quy hoạch: với 3 yếu tố tác động đã nêu, mỗi yếu tố có hai mức là mức trên và mức dưới. Vậy số thí nghiệm được tiến hành là N = 23= 8 thí nghiệm. Phương án tiến hành, ma trận quy hoạch thực nghiệm được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 4.4. Ma trận quy hoạch thực nghiệm cấp 1
TN Các yếu tố theo tỉ lệ thực Các yếu tố theo tỉ lệ mã hóa Hiệu suất trích ly CGA (H) Z1 Z2 Z3 x0 x1 x2 x3 Yu 1 55 90 40 1 -1 -1 -1 64,01 2 75 90 40 1 1 -1 -1 69,79 3 55 150 40 1 -1 1 -1 75,44
4 75 150 40 1 1 1 -1 78,9 5 55 90 60 1 -1 -1 1 67,84 6 75 90 60 1 1 -1 1 76,22 7 55 150 60 1 -1 1 1 73,61 8 75 150 60 1 1 1 1 84,03 9 65 120 50 1 0 0 0 83,26 10 65 120 50 1 0 0 0 84,56 11 65 120 50 1 0 0 0 84,89
4.2.4.2. Phân tích sự có nghĩa của mơ hình với thực nghiệm
Phân tích sự phù hợp và có nghĩa của mơ hình được đánh giá qua kết quả phân tích ANOVA (bảng 4.5) và kết quả phân tích sự phù hợp của mơ hình với thực nghiệm (bảng 4.6)
Bảng 4.5. Kết quả phân tích ANOVA cho mơ hình bậc 1
Yếu tố Tổng bìnhphương tự doBậc bình phươngTrung bình Giá trịF Giá trị pProb>F Tin cậy/Khơngtin cậy
Mơ hình 286,65 7 40,95 0,5069 0,7932 Khơng tin cậy
A 98,28 1 98,28 1,22 0,3506 Không tin cậy
B 145,52 1 145,52 1,8 0,2721 Không tin cậy
C 22,98 1 22,98 0,2845 0,6307 Không tin cậy
AC 11,42 1 11,42 0,1414 0,7319 Không tin cậy
BC 6,06 1 6,06 0,075 0,802 Không tin cậy
ABC 2,38 1 2,38 0,0294 0,8747 Không tin cậy
Sự thiếu
phù hợp 240,85 1 240,85 324,32 0,0031 Tin cậy
Bảng 4.6. Kết quả phân tích sự phù hợp của mơ hình với thực nghiệm
Thông số Giá trị Thông số Giá trị
Độ lệch chuẩn 8,99 R² 0,5419
Giá trị trung bình 76,6 R² hiệu chỉnh -0,527
Hệ số biến thiên % 11,73 R² dự đốn -106,2491
Độ chính xác phù hợp 2,612
Nhận xét: Từ bảng kết quả phân tích ANOVA cho mơ hình bậc 1 ta thấy giá trị
p của sự thiếu phù của mơ hình bằng 0,0031< 0,05. Có nghĩa là mơ hình này khơng phù hợp với thực nghiệm. Do vậy ta cần phải tiến hành quy hoạch thực nghiệm bậc 2. 4.2.4.3. Quy hoạch thực nghiệm bậc hai
Bảng 4.7. Giá trị thực nghiệm và giá trị mã hóa của các yếu tố
Nhiệt độ (oC)
Thời gian (phút)
Nồng độ dung mơi etanol
(%V) Biến thực (Z1) Biến mã hóa (x1) Biến thực (Z2) Biến mã hóa (x2) Biến thực (Z3) Biến mã hóa (x3)
55 -1 (-) 90 -1 (-) 40 -1 (-)
75 +1 (+) 150 +1 (+) 60 +1 (+)
65 0 120 0 50 0
51,47 -α 79,41 -α 36,47 -α
78,53 +α 160,59 +α 63,53 +α
Số thí nghiệm được tiến hành là N = 2k + 2k + no = 23 + 2*3 + 3 = 17 thí nghiệm. Phương án tiến hành, ma trận quy hoạch thực nghiệm được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 4.8. Ma trận quy hoạch thực nghiệm cấp 2
TN Các yếu tố theo tỉ lệ thực Các yếu tố theo tỉ lệ mã hóa
Hiệu suất trích ly CGA (H) Z1 Z2 Z3 x0 x1 x2 x3 Yu 1 55 90 40 1 -1 -1 -1 64,01 2 75 90 40 1 1 -1 -1 69,79 3 55 150 40 1 -1 1 -1 75,44 4 75 150 40 1 1 1 -1 78,9 5 55 90 60 1 -1 -1 1 67,84 6 75 90 60 1 1 -1 1 76,22 7 55 150 60 1 -1 1 1 73,61 8 75 150 60 1 1 1 1 84,03 9 51,45 120 50 1 -1,353 0 0 77,89
10 78,53 120 50 1 1,353 0 0 83,13 11 65 79,41 50 1 0 -1,353 0 75,25 12 65 160,59 50 1 0 1,353 0 86,21 13 65 120 36,47 1 0 0 -1,353 77,56 14 65 120 63,53 1 0 0 1,353 82,11 15 65 120 50 1 0 0 0 83,26