CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Phương pháp phân tích
2.1.2. Phương pháp phân tích bằng HPLC
2.1.2.1. Khái niệm
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. 2.1.2.2. Phân loại
Trong HPLC, tùy bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh (SP) trong cột tách mà người ta chia thành:
Sắc ký phân bố
Sắc ký hấp phụ, có 2 loại: + Pha thường (NP-HPLC)
+ Pha ngược hay pha đảo (RP-HPLC)
Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC)
Trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực. hợp chất ion có khối lượng phân tử khơng quá lớn (< 3000)
2.1.2.3 Các đại lượng đặc trưng trong HPLC
a, Các phương trình lưu trữ
- Thời gian lưu giữ :
Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc ký chúng sẽ bị lưu giữ ở trong một cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Đó là thời gian lưu của nó trong hệ cột đã cho. Thời gian này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rữa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại. Như vậy, nếu gọi tRi là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta ln có:
Hình 2.1. Hình biểu diễn thời gian lưu
+ t0 : thời gian để cho chất nào đó khơng có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chế.
+ t’Ri : là thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc ký. Nếu hai chất A và B kế tiếp nhau trong sắc đồ thì chúng ta có :
α = ( t’B / t’A )
α được gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B, hay hệ số tách của hai chất đó. Đại lượng α càng lớn thì sự tách của hai chất A và B càng rõ ràng. Cịn khi đại lượng này bằng 1, thì khơng có sự tách sắc ký của hai chất A và B, lúc này hai chất A và B nằm trong một pic sắc ký. Cịn nếu α gần bằng 1, thì pic sắc ký của hai chất A và B có chung một vùng. Nghĩa là chúng chập nhau không thể tách thành hai pic riêng biệt đặc trưng cho hai chất đó.
- Thể tích lưu :
Thể tích lưu của một chất là thể tích của pha động chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời gian kể từ lúc mẫu được bơm vào cột cho đến khi chất tan được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại; nghĩa là tương đương với thời gian lưu t’Ri. Nếu chất tan khơng bị lưu giữ trong cột tách thì thể tích lưu của nó sẽ bằng thể tích Vm của pha động chảy qua cột. Như vậy, nếu gọi F (ml/pH) là tốc độ của pha động được bơm qua cột sắc ký, thì chúng ta có:
VRo = Vm = tRo . F VRi = F . tRi Hay VRi = VRo ( 1 + K’i) Mặt khác ta có :
( Vs + Vm ) = V0
Trong đó V0 là thể tích trống tồn phần của cột sắc ký, Vs là thể tích thực của pha tĩnh trong cột. Nhưng vì Vm = F . tRo nên chúng ta có :
Vs = ( V – F.tRo )
Như vậy, nhờ cơng thức này chúng ta có thể tính được thể tích thực Vs của pha
tĩnh ở trong cột sắc ký.
b, Hệ số phân bố và hệ số dung tích
Q trình tách sắc ký của các chất là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong quá trình sắc ký. Sự phân bố này được đặc trưng bởi một đại lượng đươc gọi là hệ số phân bố Ki của chất i. Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ của chất tan i ở trong pha tĩnh và pha động và được tính bằng cơng thức :
Ki = Ci(sp) / Ci(mp)
Trong đó Ci(sp) và Ci(mp) là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và trong pha động. Hệ số Ki cho ta biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh).
Nhưng hệ số Ki chưa nói lên được sức chứa (dung tích) của cột sắc ký. Vì thế người ta phải đưa thêm vào hệ số dung tích K’i
. Hệ số dung tích K’i (hay hệ số dung lượng: Capacity coefficient) là chỉ cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i phân bố trong mỗi pha là bao nhiêu nghĩa là ta có :
K’i = m(Sp) / m(Mp)
Nếu trong hỗn hợp mẫu có hai chất A và B thì cũng tương tự như trong khái niệm lưu
giữ chúng ta cũng có :
α = K’B / K’A = ( tB – t0 ) / ( tA – to )
Như vậy, từ tỷ số của hệ số dung tích (α) của hai chất cũng cho ta biết khả năng tách
tách của hai chất càng rõ ràng.
c, Tốc độ tuyến tính của pha động
Trong kĩ thuật HPLC, tốc độ thể tích F (ml/phút) của pha động luôn liên quan đến tiết diện của cột tách. Vì thế người ta ít dùng khái niệm này, khi xem xét sự di chuyển của một đĩa chất tan trong cột tách, mà thường dùng tốc độ tuyến tính (cm/giây). Khái niệm tốc độ này cho ta biết trong một đơn vị thời gian (1 giây hay 1 phút), thì pha động, hay một đĩa sắc ký của chất tan dịch chuyển được bao nhiêu cm trong cột. Tốc độ này không phụ thuộc vào tiết diện của cột tách và cũng không phụ thuộc vào độ giảm áp trong cột tách theo chiều dài từ đầu cột đến cuối cột. Tốc độ này được tính theo cơng thức:
u = L / t0
Hay ta có: u = F/ ( r2.ET.π)
Trong đó L là chiều dài (cm), r là bán kính của cột sắc ký (mm), ET là hệ số về độ xốp của pha tĩnh.
d, Độ thấm dung môi của pha tĩnh
Để đánh giá một cột tách HPLC có tốt hay khơng, sau khi nạp người ta phải kiểm tra lại cột theo ba yếu tố:
- Số đĩa của cột (hay chiều cao một đĩa). - Độ cân đối của pic sắc ký.
- Độ thấm dung môi của hệ pha.
Khác với độ cân đối của pic, độ thấm dung môi (pha động) của một hệ pha lại cho chúng ta biết độ ổn định, tính cân bằng và tính lặp lại của hệ pha đó trong q trình sắc ký. Đồng thời cũng một phần nào mô tả sự diễn biến của các cân bằng phân bố trong hệ pha tốt hay khơng tốt. Tất nhiên đó chỉ là một tham số, mà thực tế còn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến vấn đề này.
Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký, người ta dùng khái niệm số đĩa N. Đây là một đại lượng, về hình thức có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc ký như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) là H. Đây là lớp có tính chất động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:
- Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt trịn hay mảnh. - Độ xốp, kích thước lỗ xốp của pha tĩnh.
- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (chất phân tích ). - Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký. - Độ nhớt của pha động.
Vì thế với một hệ pha nhất định, và trong những điều kiện sắc ký đã chọn thì chiều cao H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan, Chiều cao H này được xác định theo công thức :
H = ( L/ 16) . ( W/ tRi )2
Đây chính là chiều cao lý thuyết của một đĩa.
f, Khả năng phân giải
Hai đại lượng H và N đã nói ở trên là các hằng số đặc trưng cho một loại cột tách, nhưng chúng chưa chỉ rõ cho chúng ta biết, hai chất A và B được tách ra khỏi nhau đến mức nào, khi nó được rửa giải ra khỏi cột sắc ký. Vì thế để đánh giá độ tách của các chất trong một hệ pha, người ta còn phải cần thêm đại lượng độ phân giải R và nó được xác định theo cơng thức :
RAB = 2.( t’RA – t’RB )/ ( WA + WB )
Ở đây t’RA và t’RB là thời gian lưu hiệu lực của hai chất A và B; còn WA và WB là chiều rộng đáy của pic sắc ký của hai chất A và B.
Độ phát hiện của một chất trong một hệ pha đã chọn là phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau của quá trình sắc ký, cụ thể như:
- Thể tích hay lượng mẫu được nạp vào cột tách. - Tính chất và các thơng số đặc trưng của pha tĩnh.
- Tính chất và thành phần của pha động (có khi cả giá trị pH). - Tốc độ của pha động và kĩ thuật rửa giải.
- Độ nhạy của phát hiện của Detectơ và các đặc trưng của nó. - Hệ thống đường ống dẫn (từ van mẫu đến flowcell của Detectơ). - Tính chất của chất phân tích đối với kĩ thuật phát hiện.
- Thiết bị để ghi đo tín hiệu của chất phân tích, …
Các yếu tố này đều ảnh hưởng trong những mức độ khác nhau đến độ phát hiện của một chất phân tích. Như vậy, nếu ta chọn được các yếu tố trên ở điều kiện thích hợp nhất, thì chúng chúng ta sẽ có độ nhạy và độ phát hiện tốt nhất, và lúc này độ phát hiện chỉ cịn do bản chất của chất phân tích quyết định.
h, Nồng độ chất tan trong quá trình sắc ký
Trong quá trình sắc ký, nếu ta nạp vào cột tách một thể tích mẫu là VS ml, thì
lượng chất phân tích i được nạp vào cột tách đị sẽ là : Qi = VS . CiS
Như thế nồng độ cực đại của chất tan i được rửa giải ra ứng với thời gian lưu tRi sẽ là:
Ci, max = Qi/ (√2.π.∂vl) Trong đó ∂vl là độ lệch chuẩn theo thể tích của chất tan Xi.
Độ lệch chuẩn là một đại lượng đặc trưng cho một pic sắc ký và một quá trình tách sắc ký của một hỗn hợp. Theo qui luật phân bố Gauxơ, độ lệch chuẩn này được xác định bởi chiều rộng của pic sắc ký ứng với 0,607 chiều cao của pic sắc ký Hmax [9].
2.2.2.4. Sơ đồ và nguyên tắc hoạt động của máy HPLC
Hình 2.2. Sơ đồ hoạt động của máy sắc ký lỏng (HPLC) [9]
Trong đó: (1) Bình đựng dung môi (2) Hệ thống Gradient (3) Bơm cao áp (4) Bộ phận tiêm mẫu (5) Cột sắc kí (6) Detector (7) Bộ phận ghi tín hiệu
a, Nguyên tắc hoạt động:
• Hệ thống dung mơi (1) đóng vai trị dung mơi động được trộn với nhau theo tỉ lệ thích hợp (điều kiển bằng máy tính) và có thể thay đổi thành phần bởi hệ thống
Gradient (2)
• Pha động được bơm liên tục qua cột tách bằng hệ thống bơm cao áp (3)
• Mẫu phân tích được đưa vào cột tách bằng bộ phận tiêm mẫu (4), sau đó được pha động đẩy vào cột tách (5), quá trình tách xảy ra ở đây.
• Các chất sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào detector (6) thích hợp và được chuyển thành thế hiệu điện rồi được khuếch đại và chuyển đến bộ phận tự ghi và xử lí kết quả ở (7)
b, Khi vận hành máy sắc kí cần lưu ý một số vấn đề sau:
- Đưa mẫu vào: bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào rất cao.
- Thời gian lưu của mẫu: Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến khi đỉnh (pic) hiển thị rõ nét. Khoảng thời gian này bị chi phối bởi các yếu tố:
+ Áp suất đầu vào
+ Tính chất của pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt) + Thành phần dung mơi
+ Nhiệt độ cột.
- Máy dị (Detector): Có nhiều phương pháp để nhận biết các thành phần trong hỗn hợp sau khi đi qua cột. Phương pháp hay được sử dụng là phương pháp hấp thụ tia cực tím (tia UV). Các hợp chất hữu cơ thường hấp thụ tia UV, mỗi chất hấp thụ mạnh nhất đối với một bước sóng nhất định. Chiếu tia UV xuyên qua dòng hỗn hợp ở đầu ra, ở phía đối diện đặt một máy dị ta có thể đo được mức độ hấp thụ tia UV. Từ đó có thể tính tốn nồng độ các chất. Nên nhớ dung mơi cũng hấp thụ tia UV, vì vậy nên lựa chọn các bước sóng sao cho thích hợp.
- Dịch kết quả từ máy dò: Kết quả ra thường gồm một dãy pic, mỗi pic đại diện cho
một hợp chất trong hỗn hợp đi qua cột hấp phụ và hấp thụ tia UV. Ta có thể điều khiển điều kiện của cột hấp phụ và thời gian lưu để xác định sự có mặt của các hợp chất. Những tham số điều khiển này đã được đo trước với các mẫu thử.
Tuy nhiên, từ các peak này ta cịn có thể định lượng được các hợp chất. Giả sử có một hợp chất X. Chúng ta đưa một dung dịch có một lượng hợp chất X đã biết trước vào máy. Từ đó, có thể xác định được thời gian lưu cũng như sự tương ứng giữa khối lượng chất X và hình ảnh của peak. Diện tích bên dưới peak ứng với số lượng chất X đi qua máy dị và diện tích này có thể tính được nhờ máy tính nối với màn hình (như hình sau):
Hình 2.3. Peak lớn
Nếu nồng độ chất X nhỏ hơn trong mẫu, nếu ta vẫn giữ nguyên các tham số máy ta sẽ thu được một peak nhỏ hơn (như hình sau):
Hình 2.4. Peak nhỏ
Kết quả này là sự so sánh tương đối với mẫu thử nên cũng có nghĩa ta có thể điều chỉnh máy đo để có thể nhận ra các chất có hàm lượng rất nhỏ.
Kết hợp với một máy ghi phổ khối: Một máy ghi phổ khối sẽ biến đổi các peak thành các vạch. Từ đó so sánh với dữ liệu có sẵn, chúng ta sẽ biết được sự có mặt của nhiều hợp chất mà khơng cần quan tâm đến thời gian lưu của chất đó khi đi qua cột hấp phụ.
2.2. Phương pháp xử lý thống kê
Quy hoạch thực nghiệm là phương pháp quan trọng trong thống kê tốn học và có nhiều ứng dụng rộng rãi, đặc biệt trong kỹ thuật hóa học nói riêng. Trong phần này sẽ nêu sơ lược về nguyên lí của phương pháp này.
2.2.1. Các khái niệm cơ bản
2.2.1.1. Định nghĩa
Quy hoạch thực nghiệm là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra mơ hình tốn, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng.
2.2.1.2. Đối tượng của quy hoạch thực nghiệm trong các ngành cơng nghệ
Là một q trình hoặc hiện tượng nào đó có những tính chất, đặc điểm chưa biết cần nghiên cứu. Người nghiên cứu có thể chưa hiểu biết đầy đủ về đối tượng nhưng đã có một số thơng tin tiên nghiệm dù chỉ là sự liệt kê sơ lược những thơng tin biến đổi, ảnh hưởng đến tính chất đối tượng.
2.2.1.3. Kế hoạch thực nghiệm
Đối với các thực nghiệm tích cực, miền tác động là miền các giá trị có thể có của các yếu tố Z trong thực nghiệm. Trong miền tác động có miền quy hoạch - miền giá trị của các yếu tố vào Z - trong đó chứa vừa đủ các điểm thí nghiệm của thực nghiệm. Nói cách khác, đó là miền tạo bởi phạm vi thay đổi các yếu tố Z theo kế hoạch thực nghiệm xác định. Kế hoạch thực nghiệm bao gồm các điểm thí nghiệm gọi là điểm của kế hoạch. Đó là một bộ (cịn gọi là phương án) kết hợp các giá trị cụ