I. Phương pháp xác định độ pH
Nguyên tắc
Giá trị pH là số đo hoạt độ ion H+. Đo chênh lệch điện thế giữa điện cực thủy tinh và điện cực so sánh được nhúng ngập trong mẫu thử.
Thuốc thử và vật liệu thử
Sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước được sử dụng ít nhất đạt loại 3 theo TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).
Dung dịch kali clorua bão hòa, khoảng 4 M, dùng để bảo quản điện cực so sánh
Cân khoảng 75 g ± 1 g kali clorua, cho vào 250 ml ± 1 ml nước, đun nhẹ để hòa tan, nếu cần.
Dung dịch đệm kali phthalat trong axit (dung dịch đệm chuẩn pH 4.0), 0.0496 M
Cân 10.12 g kali hydro phthalat (KHC8H4O4) đã sấy trước ở 110°C trong 2h, hịa tan vào nước đựng trong bình định mức 1 lít và thêm nước đến vạch.
Dung dịch đệm phosphat (dung dịch đệm chuẩn pH 7.0), 0.0249 M
Cân 3.387 g kali dihydro phosphat (KH2PO4) và 3.533 g natri hydro phosphat
(Na2HPO4), đã sấy trước ở 110°C đến 130°C trong 2h trước khi sử dụng, hòa tan vào nước đựng trong bình định mức 1 lít và thêm nước đến vạch.
Dung dịch natri hydroxit, 0.1 M. Dung dịch axit clohydric, 0.1 M. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:
Máy đo pH, có thang chia độ ≤ 0,1 đơn vị pH và độ tái lập là 0.05 đơn vị pH hoặc
máy đo khác có màn hình hiện số với khả năng tương tự.
Bộ điện cực, gồm điện cực thủy tinh và điện cực so sánh calomel, đơn hoặc kết hợp.
Bảo quản điện cực so sánh calomel ngập trong dung dịch kali clorua bão hịa. Duy trì nhiệt độ ổn định khoảng 25°C đối với điện cực, dung dịch đệm chuẩn và mẫu thử. Ngâm điện cực mới vài giờ trong nước cất hoặc nước đã khử ion trước khi sử dụng. Bảo quản điện cực thủy tinh trong dung dịch đệm kali phthalat.
Nếu sử dụng điện cực kết hợp, bảo quản điện cực trong dung dịch đệm kali phthalat và thêm vài giọt dung dịch kali clorua bão hòa.
Bảo quản các điện cực ngập hoàn toàn trong dung dịch bảo quản.
Trước khi sử dụng, rửa các điện cực bằng chính dịch lỏng cần đo pH. Nếu không đủ vật liệu mẫu thử thì rửa các điện cực bằng nước cất hoặc nước khử ion. Độ trễ trong đáp ứng của dụng cụ đo có thể cho thấy hiệu ứng lão hóa hoặc điện cực bị bẩn, cần làm sạch và làm mới các điện cực. Làm sạch các điện cực bằng cách ngâm 1 min trong dung dịch natri hydroxit 0.1M sau đó ngâm 1 min trong dung dịch axit clohydric 0.1M. Lặp lại hai lần, cuối cùng rửa các điện cực trong dung dịch axit clohydric 0.1M. Dầu và mỡ từ mẫu thử có thể bám vào các điện cực, do đó phải làm sạch các điện cực bằng etyl ete và thường xuyên chuẩn hóa lại dụng cụ, thường là sau 3 phép xác định. Rửa kỹ các điện cực bằng nước trước khi tiến hành chuẩn hóa.
Sàng số 8. Máy trộn.
Nồi cách thủy, có thể ổn định nhiệt độ ở 25°C ± 1°C.
Nhiệt kế, có số đọc đến 0.1°C hoặc có đầu dị nhiệt thích hợp. Lấy mẫu
Mẫu gửi đến phịng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Cách tiến hành
Hiệu chuẩn máy đo pH
Hiệu chuẩn máy đo pH tương tự (analog)
Ghi lại nhiệt độ dung dịch đệm và cài đặt bộ kiểm soát bù nhiệt của dụng cụ ở nhiệt độ quan sát được (khoảng 25°C). Chuẩn hóa dụng cụ và điện cực bằng dung dịch đệm kali phthalat.
Rửa các điện cực bằng nước cất hoặc nước đã khử ion và dùng khăn mềm thấm (không được lau).
Nhúng điện cực vào dung dịch đệm và đọc pH, để máy đo ổn định 1 min. Điều chỉnh để máy đo đọc tương ứng với độ pH đã biết của dung dịch đệm (khoảng 4.0) đối với nhiệt độ môi trường. Rửa các điện cực bằng nước cất hoặc nước đã khử ion và thấm bằng khăn mềm.
Kiểm tra thang đo mở rộng của các máy đo pH với dung dịch đệm chuẩn pH 4.0 hoặc pH 7.0. Dung dịch đệm và máy đo pH có thể được kiểm tra thêm bằng cách so sánh với các giá trị thu được khi sử dụng máy đo pH chuẩn khác.
Kiểm tra khoảng hoạt động của điện cực chỉ thị bằng cách sử dụng 2 dung dịch đệm riêng biệt. Ví dụ, đầu tiên chuẩn hóa điện cực bằng cách sử dụng đệm pH 7.0 ở 25°C. Điều chỉnh để máy đo đọc chính xác 7.0. Rửa các điện cực bằng nước, thấm bằng khăn mềm và nhúng trong dung dịch đệm pH 4.0. Nếu điện cực bị lỗi khi kiểm tra khoảng hoạt động thì cần phải hoạt hóa hoặc thay thế điện cực.
Hiệu chuẩn máy đo pH kỹ thuật số
Cân bằng nhiệt độ của các điện cực, dung dịch đệm và dung dịch mẫu thử ở cùng nhiệt độ (khoảng 25°C) và hiệu chuẩn máy đo pH theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cài đặt bộ kiểm soát bù nhiệt của dụng cụ ở nhiệt độ quan sát. Khuấy nhẹ trước khi xác định pH của dung dịch đệm hoặc dung dịch mẫu thử.
Máy đo pH kỹ thuật số có kiểm sốt độ dốc
Chọn 2 dung dịch đệm chuẩn, tốt nhất là có pH khác nhau khơng q 3 đơn vị và do đó độ pH dự kiến của mẫu được kiểm tra nằm trong dải của chúng, nghĩa là các dung dịch đệm chuẩn có pH 4.0 và 7.0. Để có kết quả chính xác nhất, chọn dung dịch đệm chuẩn có độ pH gần với pH của dung dịch cần được đánh giá. Đầu tiên chuẩn hóa máy đo trong dung dịch đệm pH có kiểm sốt chuẩn hóa (pH 7.0) và sau đó kiểm sốt độ dốc để chuẩn hóa máy đo trong dung dịch đệm pH 4.0. Quy trình này thiết lập đáp ứng (độ dốc) thiết bị thích hợp đối với điện cực pH cụ thể được sử dụng và kết quả cho số đọc pH chính xác hơn.
Đơi khi gặp khó khăn khi điện cực kết hợp bị trôi. Khi điều này xảy ra, xác định và hiệu chính nguồn gây trơi điện cực. Nguyên nhân gây ra thường là do mối nối của điện cực so sánh.
Chuẩn bị mẫu thử theo dạng sản phẩm
Đối với mẫu dạng lỏng, để nhiệt độ cân bằng ở khoảng 25°C và nhúng điện cực trong phần mẫu thử dạng lỏng để xác định pH.
Đối với mẫu dạng rắn, cho mẫu lên sàng số 8 và trộn thành dạng nhão. Để nhiệt độ của hỗn hợp đã chuẩn bị cân bằng đến 25°C và xác định pH.
Đối với mẫu gồm hỗn hợp cả dạng lỏng và dạng rắn, trộn các phần mẫu thử đại diện dạng lỏng và dạng rắn của mẫu thử với cùng tỷ lệ chất lỏng: chất rắn như mẫu ban đầu, trộn thành dạng nhão. Để nhiệt độ của hỗn hợp chuẩn đã chuẩn bị cân bằng đến 25°C và xác định pH.
Nếu máy đo pH được trang bị thiết bị bù nhiệt thì có thể dùng thiết bị này để cân bằng các mẫu đến nhiệt độ xác định trong khoảng 25°C ± 15°C.
Chuẩn bị mẫu thử cụ thể
Đối với sản phẩm có pH chưa ổn định Sản phẩm chứa cả thành phần rắn và lỏng
Chuyển lượng mẫu trong vật chứa lên sàng số 8 đặt nghiêng góc từ 17°C đến 20°C trong 2 phút để tách pha rắn - lỏng. Ghi lại khối lượng phần lỏng và phần rắn, bảo quản riêng hai phần.
Nếu phần chất lỏng chứa lượng dầu gây ra sai lệch điện cực, thì phải tách dầu và giữ lại lớp nước, điều chỉnh nhiệt độ đến 25°C và xác định pH.
Lấy phần chất rắn còn trên sàng, trộn để thu được hỗn hợp bột nhão đồng nhất, điều chỉnh nhiệt độ đến 25°C và xác định pH.
Trộn đều đến đồng nhất phần chất rắn và chất lỏng với cùng tỷ lệ như trong mẫu ban đầu. Điều chỉnh nhiệt độ đến khoảng 25°C và xác định pH.
Các sản phẩm chứa dầu
Tách dầu ra khỏi phần chất rắn và trộn phần chất rắn thành bột nhão trong máy trộn. Thêm một lượng nước không lớn hơn 20 ml/100g sản phẩm (nước không chứa
cacbonic), nếu cần. Điều chỉnh nhiệt độ của hỗn hợp đến khoảng 25°C, nhúng các điện cực và xác định pH.
Sản phẩm bán rắn (bánh pudding, salad khoai tây)
Trộn phần mẫu thử thành dạng nhão, thêm lượng nước không chứa cacbonic với tỷ lệ từ 10ml đến 2 ml cho mỗi 100g sản phẩm, nếu cần. Điều chỉnh nhiệt độ của hỗn hợp đến khoảng 25°C và xác định pH.
Hỗn hợp sản phẩm đặc biệt
Tách hết dầu, trộn đều phần sản phẩm còn lại thành dạng nhão, thêm lượng nước không chứa cacbonic với tỷ lệ từ 10ml đến 20ml cho mỗi 100g sản phẩm, nếu cần. Điều chỉnh nhiệt độ của hỗn hợp đến khoảng 25°C và xác định pH.
Sản phẩm có pH cân bằng
Nếu sản phẩm được bảo quản trong thời gian đủ lâu để cân bằng pH thì pH được xác định như sau:
Xác định pH trong vật chứa hỗn hợp
Sản phẩm ngâm dầu
Tách phần dầu theo 7.4.1.2 và đo pH.
Đo pH
Điều chỉnh nhiệt độ của phần mẫu thử đến khoảng 25°C và cài đặt bộ kiểm soát bù nhiệt đến nhiệt độ quan sát được. Với một số máy đo pH có thang đo mở rộng, nhiệt độ mẫu thử phải bằng nhiệt độ dung dịch đệm được sử dụng để hiệu chuẩn.
Rửa điện cực và thấm bằng khăn mềm. Nhúng điện cực vào mẫu và đọc pH, để máy đo ổn định 1 min. Rửa và thấm điện cực bằng khăn mềm, sau đó lặp lại với phần mẫu thử mới.
Xác định 2 giá trị pH trên mỗi mẫu thử. Các số đọc gần bằng nhau cho thấy phần mẫu thử đã đồng nhất.
Biểu thị kết quả
Báo cáo kết quả độ pH đo được đến hai chữ số thập phân ở 25°C.
Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
II. Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4884-2:2015 (ISO 4833-2:2013 đính chính kỹ thuật 1:2014) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng vi sinh vật - Phần 2: Đếm khuẩn lạc ở 30OC bằng kỹ thuật cấy bề mặt
Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng vi sinh vật có thể phát triển và hình thành khuẩn lạc trong mơi trường đặc sau khi ủ hiếu khí ở 30OC. Tiêu chuẩn này áp dụng cho:
1) Các sản phẩm chứa các vi sinh vật nhạy cảm với nhiệt chiếm ưu thế trong hệ tổng số (ví dụ: các vi sinh vật ưa lạnh trong thực phẩm đông lạnh và ướp lạnh, thực
phẩm khơ, các thực phẩm khác có thể chứa các vi sinh vật nhạy cảm với nhiệt). 2) Các sản phẩm có chứa vi khuẩn hiếu khí bắt buộc có khả năng tạo thành tỷ lệ đáng
kể trong hệ tổng số (ví dụ Pseudomonas spp.).
3) Các sản phẩm có chứa các hạt nhỏ có thể rất khó phân biệt với các khuẩn lạc trong đĩa rót.
4) Các sản phẩm sẫm màu làm cản trở việc nhận biết khuẩn lạc trong đĩa rót.
5) Các sản phẩm được đánh giá chất lượng cần được phân biệt thơng qua các lồi khuẩn lạc khác nhau.
Ngoài kỹ thuật cấy đĩa bằng tay, tiêu chuẩn này cũng quy định sử dụng thiết bị cấy xoắn, phương pháp nhanh để thực hiện đếm khuẩn lạc bề mặt.
Khả năng áp dụng của tiêu chuẩn này bị hạn chế khi kiểm tra các thực phẩm lên men và thức ăn chăn ni các mơi trường hoặc điều kiện ủ khác thích hợp hơn. Tuy nhiên, phương pháp này có thể áp dụng cho các sản phẩm đó mặc dù khơng phát hiện hiệu quả các vi sinh vật chiếm ưu thế trong các sản phẩm.
Đối với một vài nền mẫu, phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này có thể cho các kết quả khác với các kết quả thu được khi sử dụng phương pháp quy định trong TCVN 4884-1 (ISO 4833-1).
Nguyên tắc
Lượng quy định của mẫu thử hoặc lượng quy định của huyền phù ban đầu trong trường hợp các sản phẩm ở dạng khác, được rót lên bề mặt mơi trường ni cấy thạch đặc đựng trong đĩa Petri.
Các đĩa khác được chuẩn bị trong cùng một điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu.
Các đĩa được ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30°C trong 72h.
Tính số lượng vi sinh vật trong một gam hoặc một mililit mẫu thử theo số lượng khuẩn lạc thu được trong các đĩa có chứa ít hơn 300 khuẩn lạc.
Dịch pha loãng
Sử dụng dịch pha loãng quy định trong TCVN 6507 (ISO 6887) đối với sản phẩm liên quan hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra.
Môi trường thạch: thạch đếm đĩa (PCA).
Bảng 1. Thành phần môi trường thạch đếm đĩa (PCA)
Sản phẩm thủy phân casein bằng
enzym 5.0g
Chất chiết nấm men 2.5g
Glucose (C6H12O6), khan 1.0g
Thạcha từ 9g đến 18g
Nước 1000 ml
a : Tùy thuộc vào sức đơng của thạch.
Chuẩn bị
Hịa tan các thành phần trên hoặc mơi trường hồn chỉnh khơ vào nước, đun nóng nếu cần. Trộn kỹ và để yên trong vài phút.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7.0 ± 0.2 ở 25OC, sử dụng máy đo pH, nếu cần. Phân phối mơi trường vào các bình hoặc chai có dung tích thích hợp. Khử trùng trong nồi hấp áp lực ở 121OC trong 15 min.
Nếu sử dụng ngay thì làm nguội mơi trường trong nồi cách thủy duy trì nhiệt độ từ 47OC đến 50OC trước khi sử dụng. Nếu không, để mơi trường đơng đặc lại trong bình hoặc chai. Trước khi sử dụng, làm tan chảy hồn tồn mơi trường trong nồi cách thủy đun sôi, rồi để nguội trong nồi cách thủy duy trì nhiệt độ từ 47OC đến 50OC.
Chuẩn bị các đĩa thạch
Rót từ 15 ml đến 20 ml mơi trường vào dãy các đĩa Petri vô trùng và để cho đơng đặc. Các đĩa này có thể bảo quản ở nhiệt độ (5 ± 3)OC đến 4 tuần.
Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch theo quy định trong TCVN 8128 (ISO 11133).
Thiết bị, dụng cụ
Có thể sử dụng dụng cụ dùng một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh và chất dẻo dùng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp.
Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:
Tủ sấy để khử trùng khô và nồi hấp áp lực để khử trùng ướt, theo TCVN 6404 (ISO 7218).
Tủ ấm hoặc tủ sấy, được thơng gió đối lưu để làm khơ các đĩa, có thể duy trì nhiệt độ từ 37OC đến 55OC hoặc tủ cấy vi sinh.
Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ từ 30OC ± 1OC.
Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ từ 47OC đến 50OC và có thể duy trì nước ở nhiệt độ sơi.
Máy đo pH, có độ chính xác đến ± 0.1 đơn vị pH ở 25OC.
Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm hoặc 140 mm.
Pipet chia vạch xả hết, vơ trùng, dung tích danh nghĩa 0.1 ml và 1 ml, phù hợp với loại A hoặc pipet tự động trong TCVN 7150-2 (ISO 835-2) sử dụng đầu tip vô trùng.
Thiết bị đếm khuẩn lạc (tùy chọn), cơ học hoặc điện tử có nền được rọi sáng thích hợp. Bình hoặc chai, có dung tích tích hợp để chuẩn bị, khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy, nếu cần.
Que dàn mẫu, bằng thủy tinh, chất dẻo hoặc bằng thép không gỉ, vô trùng, để dàn chất cấy trên bề mặt môi trường nuôi cấy.
Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể về lấy mẫu sản phẩm có liên quan. Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên liên quan tự thỏa thuận về vấn đề này.
Phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và khơng bị hư hỏng thay đổi trong q trình vận chuyển hoặc bảo quản.