12 Biến đổi gen thực vật
122 Sử dụng promoter trong công nghệ chuyển gen thực vật
Promoter thực vật
giúp điều khiển quá trình khởi đầu phiên mã để tạo các RNA Về cấu trúc, promoter gồm các vùng chính là vùng lõi (core), vùng cận biên (proximal) và ngoại biên (distal) (hình 1 13) Vùng lõi, thƣờng nằm cách vị trí bắt đầu phiên mã - 40 base pair (bp) về phía thƣợng nguồn, chứa các trình tự (TATA box, Initiator element) là vùng gắn của những nhân tố phiên mã chung (GTF, general transciption factor) và RNA polymerase, tạo thành phức hợp khởi đầu phiên mã (PIC, preinitiation complex) Những thay đổi ở vùng này sẽ ảnh hƣởng lớn đến khả năng phiên mã, biểu hiện của gen Vùng promoter cận biên thƣờng và ngoại biên thƣờng nằm ở phía thƣợng nguồn vùng promoter lõi (vùng ngoại biên nằm xa hơn cận biên) Hai vùng này gồm các trình tự nucleotide có chức năng điều hịa phiên mã khác nhau nhƣ tăng cƣờng, ức chế, hoạt hóa Trong q trình khởi đầu phiên mã, những nhân tố phiên mã gắn với trình tự DNA chun biệt có chức năng điều hòa trên promoter đồng thời tƣơng tác với phức hợp khởi đầu phiên mã (PIC) Phức hợp tƣơng tác DNA/protein này giúp hoạt hóa, tăng cƣờng hay ức chế sự phiên mã Có thể thấy, điều hịa phiên mã phụ thuộc nhiều yếu tố nhƣ hoạt động của các nhân tố phiên mã, loại, số lƣợng, vị trí và sự kết hợp của các yếu tố điều hòa trên promoter [79][80]
Hình 1 13 Mơ hình cơ bản về cấu trúc và điều hòa phiên mã của gen mã hóa
protein [79]
Các loại promoter đƣợc sử dụng trong cơng nghệ gen thực vật
Promoter đóng vai trị quan trọng hàng đầu quyết định sự biểu hiện của gen biến nạp trong thực vật chuyển gen, do đó tùy vào yêu cầu, mục đích nghiên cứu cụ thể cần có sự lựa chọn promoter phù hợp Hiện nay, promoter sử dụng trong công nghệ gen thực vật có nguồn gốc từ nhiều sinh vật khác nhau nhƣ: thực vật, vi khuẩn,
vi rút và đƣợc phân thành 4 nhóm chính gồm: promoter liên tục (constitutive promoter), promoter cảm ứng (inducible promoter), promoter chuyên biệt (spatiotemporal promoter) và promoter tổng hợp (synthetic promoter) [80]
Promoter liên tục: là những promoter luôn hoạt động dẫn đến gen biểu hiện liên tục không phụ thuộc loại mô, tế bào, điều kiện môi trƣờng, giai đoạn phát triển Những promoter này thƣờng có thể hoạt động trên nhiều giống, loài, giới, nhƣ promoter của virus khảm súp lơ (CaMV35S), promoter opine, promoter ubiquitin thực vật (Ubi), promoter actin1 của gạo (Act-1)
Promoter cảm ứng: là những promoter mà hoạt động đƣợc cảm ứng bởi các tín hiệu bên trong, bên ngồi tế bào, hay do ảnh hƣởng của mơi trƣờng Promoter cảm ứng đƣợc ứng dụng phổ biến trong công nghệ di truyền thực vật do sự biểu hiện gen có thể đƣợc bật hoặc tắt bởi sự phun các hóa chất hoặc xử lý các tín hiệu vật l , nhƣ các stress sinh học, phi sinh học gồm điều kiện sáng tối, nhiệt độ cao, thấp, mầm bệnh, hóa chất (cồn, hormone, kim loại, steroid, kháng sinh )
Promoter chuyên biệt (vị trí, thời gian: spatiotemporal promoter): điều khiển sự biểu hiện gen trong tế bào, mô, cơ quan chuyên biệt của một sinh vật ở một giai đoạn phát triển cụ thể Promoter chuyên biệt có thể giúp nâng cao khả năng biểu hiện của gen biến nạp ở một cơ quan nhất định do đó tiết kiệm đƣợc năng lƣợng và dinh dƣỡng khi protein đích khơng cần thiết biểu hiện trên tồn cây Ngoài ra, điều này cũng nâng cao hơn khía cạnh an tồn sinh học của cây chuyển gen Nhiều promoter chuyên biệt đã đƣợc sử dụng, ly trích từ nhiều nguồn nhƣ: glycinin chuyên biệt hạt từ đậu tƣơng, PGNpr2 chuyên biệt phôi từ ngô,
Promoter tổng hợp là những promoter đƣợc thiết kế để kết hợp theo mong muốn những trình tự promoter lõi, vùng promoter cận biên (proximal) và vùng promoter ngoại biên (distal), do đó có thể giúp điều khiển sự biểu hiện gen theo cách khơng có trong tự nhiên Promoter tổng hợp có thể đƣợc cấu trúc dựa trên sự kết hợp của các yếu tố cis gồm yếu tố tăng cƣờng (enhancer), hoạt hóa (activator) hoặc ức chế (repressor) ở phía thƣợng nguồn (upstream) của trình tự promoter lõi Những sắp xếp này có thể giúp promoter tổng hợp điều khiển sự biểu hiện gen một cách chính xác Ví dụ: promoter CaMV35S có trình tự tăng cƣờng đƣợc nhân đơi giúp nâng cao mức độ biểu hiện gen và đã đƣợc ứng dụng trong nhiều nghiên cứu [79]
Promoter biểu hiện gen chuyên biệt hạt ở đậu tƣơng
Sự biểu hiện gen chuyên biệt ở hạt có thể giúp nâng cao hàm lƣợng chất quan tâm trong hạt, đồng thời hạn chế ảnh hƣởng của gen biến nạp ở các bộ phận khác trên cây, cũng nhƣ đảm bảo sự sinh trƣởng, phát triển bình thƣờng của cây chuyển gen Trong hạt đậu tƣơng, protein chiếm hàm lƣợng rất cao, khoảng 40% trọng lƣợng khơ, trong đó chủ yếu là glycinin (40% protein tổng) và β-conglycinin (30% protein tổng), có vai trị dự trữ cacbon và nitơ Gen biểu hiện các protein này hoạt động mạnh, chuyên biệt ở hạt nên promoter của chúng rất phù hợp để điều khiển biểu hiện gen ngoại lai chuyên biệt hạt ở đậu tƣơng nói riêng và các loại cây khác nói chung [81] Một số nghiên cứu đã ghi nhận đƣợc các yếu tố điều hòa biểu hiện gen glycinine nhƣ nhƣ yếu tố RY (5'- CATGCATG-3') có vai trị quan trọng trong việc điều khiển mức độ biểu hiện gen trong hạt, yếu tố cis "CACA" nằm ở vùng 5' tƣơng tác với yếu tố phơi trong điều hịa biểu hiện gen [82]
Promoter của gen glycinin đậu tƣơng đã đƣợc nhiều nghiên cứu sử dụng để biểu hiện gen ngoại lai trên hạt Ding và cộng sự (2006) nghiên cứu chuyển gen tổng hợp yếu tố phát triển nguyên bào sợi cơ bản ở ngƣời (human basic fibroblast growth factor, bfgf) và gus vào đậu tƣơng sử dụng promoter glycinin và CaMV35S cho các gen biến nạp Kết quả khi sử dụng promoter glycinin cho cả gen bfgf và gus đều cho thấy sự biểu hiện chun biệt của gen (mRNA, protein) ở hạt, khơng có sự biểu hiện của các gen này trên các bộ phận khác của cây Ngoài ra, khi so sánh mức độ biểu hiện cũng cho thấy promoter glycinin giúp tăng khả năng tổng hợp protein so với promoter liên tục điển hình là CaMV35S (trung bình 1,2% so với 0,04%) [81] Moravec và cộng sự (2007) sử dụng promoter glycinine cũng đã biểu hiện đƣợc hàm lƣợng cao protein tái tổ hợp LB toxin của vi khuẩn E coli trong hạt đậu tƣơng chiếm 2,4% protein tổng số trong hạt, trong khi sử dụng promoter CaMV35S ở đậu tƣơng chỉ thu đƣợc lƣợng protein tái tổ hợp cao nhất là 0,5% protein tổng [83] Nhƣ vậy, các kết quả này chỉ ra rằng promoter glycinin có thể giúp biểu hiện gen ngoại lại ở mức độ cao và chuyên biệt ở hạt đậu tƣơng, do đó là promoter tiềm năng có thể đƣợc ứng dụng khi cần biểu hiện gen chuyên biệt ở hạt đậu tƣơng