DNA tổng số đƣợc tách từ các dòng đậu tƣơng bằng bộ kit The
DNeasy Plant Kit – QIAGEN hoặc theo phƣơng pháp của Dellaporta và cộng sự (1983) [155] DNA này là nguyên liệu để thực hiện các kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR và Southern blot
Qui trình tách chiết theo Dellaporta, 1983: Khoảng 200 mg mẫu lá đƣợc làm đông trong nitơ lỏng, rồi dùng chày nghiền mẫu thành bột mịn trong cối Sau đó, bột lá đƣợc chuyển sang eppendorf 1,5 ml, cho thêm vào 500 µl dịch ly trích, 80µl SDS 10%, trộn đều hỗn hợp Eppendorf đƣợc ủ ở 65oC trong 10 phút Thêm 600 µl Potassium acetate 5M và trộn đều hỗn hợp, ủ ở 0oC trong ít nhất 20 phút Dung dịch đƣợc ly tâm 14 000 vòng/phút trong 20 phút Hút dịch nổi vào 1 eppendorf mới,
thêm vào 1 ml isopropanol lạnh Trộn đều hỗn hợp và ủ ở -20oC trong 30 phút Tiếp theo, ly tâm dung dịch 13 000 vòng/phút trong 10 phút, rồi loại bỏ dịch nổi, làm khơ phần lắng Hịa tan mẫu trong 0,7 ml Tris 50mM, EDTA 10mM, pH 8, ly tâm hỗn hợp 13 000 vòng/phút trong 10 phút Chuyển phần dịch nổi sang eppendorf mới, thêm Phenol/isoamyl alcohol (1:1) bằng với thể tích dịch nổi thu đƣợc, trộn đều và ly tâm hỗn hợp 13 000 vòng/phút trong 10 phút Chuyển phần dịch nổi sang eppendorf mới, thêm Sodium acetate 3M bằng 1/10 thể tích dịch nổi thu đƣợc và 500 µl isopropanol Trộn đều, sau đó ly tâm hỗn hợp 13 000 vịng/phút trong 10 phút Rửa mẫu với 1 ml ethanol 80% lạnh Làm khơ mẫu và hịa tan lại trong 100 µl Tris 10mM, EDTA 1mM, pH 8 Cuối cùng, thêm 2µl RNAse ủ ở 37 oC trong 30 phút để loại bỏ RNA trong mẫu DNA thu đƣợc có thể sử dụng ngay hay bảo quản ở - 20 oC
Kiểm tra sự hiện diện của các gen biến nạp trong bộ gen cây bằng phƣơng pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu
Thành phần của phản ứng PCR gồm có 5l buffer PCR 5X, 0,5l dNTP 10 mM, 0,25l taq polymerase 5 U/µl, 2l mồi xi 1M, 2l mồi ngƣợc 1M, 1l DNA plasmid, thêm nƣớc cất đủ thể tích 25 µl
Mồi và các chƣơng trình nhiệt đối với các gen mục tiêu
Các cặp mồi sử dụng để khuếch đại đoạn các đoạn gen chuyên biệt cbfd2,
hbfd1, Zm-psy đƣợc thiết kế bằng phần mềm Primer3, cặp mồi gen bar tham khảo
theo Maqbool và cộng sự 2009 [157] - Gen cbfd2:
+ Mồi xuôi (p1): 5’ -GAT AGC GAA CAC GTC GTT GA - 3’ + Mồi ngƣợc (p2): 5’ - AGC CTC CTT GCC TTC TTT TC - 3’ + Kích thƣớc đoạn khuếch đại tƣơng ứng 500 bp
+ Chƣơng trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/4 phút [94oC/90 giây, 60oC/90 giây, 72oC/ 2 phút], 72oC/5 phút Số chu kỳ: 35
- Gen hbfd1:
+ Mồi xuôi (p3): 5’ - CTT TCC CAC ACC TTT TCC AA - 3’ + Mồi ngƣợc (p4): 5’ -GCA AGC AGA GAA GTG CAC AG - 3’ + Kích thƣớc đoạn khuếch đại tƣơng ứng 400 bp
+ Chƣơng trình nhiệt phản ứng PCR: 94 oC/4 phút [94oC/90 giây, 60oC/90 giây, 72oC/ 2 phút], 72oC/5 phút Số chu kỳ: 35
- Gen bar:
+ Mồi xuôi (p5): 5’- ATG AGC CCA GAA CGA CG -3’ + Mồi ngƣợc (p6): 5’- TCA GAT CTC GGT GAC GG -3’ + Kích thƣớc đoạn DNA đƣợc khuếch đại là 500 bp
+ Chƣơng trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/5 phút [94oC/1 phút, 62oC/1 phút, 72oC/1 phút 30 giây],72oC/5 phút Số chu kỳ: 35
- Gen Zm-psy:
+ Mồi xuôi (p7): 5'-TTG GAT GCT GCT CTT TCA GA-3' + Mồi ngƣợc(p8): 5'-CCT CTT TCA GCT TCC TCG AA-3' + Kích thƣớc đoạn DNA đƣợc khuếch đại là 446 bp
+ Chƣơng trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/5 phút [94oC/1 phút, 58oC/1 phút, 72oC/1 phút 30 giây],72oC/5 phút Số chu kỳ: 35
Sản phẩm PCR bảo quản ở 4oC cho đến khi dùng Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với thang chuẩn 1kb Promega Xem kết quả, chụp hình gel bằng máy Gel Documentation – Biorad