Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt
2 2 1 Tuyển chọn giống đậu tương
Tuyển chọn các giống đậu tƣơng đã thuần hóa, có năng suất cao, chống chịu sâu bệnh tốt, trồng phổ biến
Kiểm tra hàm lƣợng β-carotene của các giống đậu tƣơng tuyển chọn đƣợc bằng phƣơng pháp sắc k HPLC do đây là cơ chất cần có để các enzyme (mã hóa bởi các gen biến nạp) chuyển hóa tạo astaxanthin
Những dịng đậu tƣơng có hiện diện β-carotene đƣợc kiểm tra khả năng nảy mầm nhằm đảm bảo sự ổn định, chính xác, hiệu quả trong q trình thí nghiệm Kiểm tra khả năng nảy mầm của hạt bằng cách gieo hạt trên giấy thấm ƣớt đặt trong đĩa petri Mỗi đĩa gieo 20 hạt, lặp lại 3 lần Sau 5 ngày kiểm tra số lƣợng hạt nảy mầm
2 2 2 Khử trùng hạt
Khử trùng bằng khí clo
Cho hạt đậu tƣơng vào đĩa petri 90 x 15 mm trải thành một lớp Xếp các đĩa này, với nắp đƣợc để mở, và một cốc đong 250 ml vào bình hút ẩm kín Cho vào cốc đong 100 ml nƣớc Javel (Hàm lƣợng clo 38 g/l) và thêm 3,5 ml HCl (12 N) bằng cách đổ dọc theo thành cốc Đóng nắp bình hút ẩm và giữ trong thời gian khác nhau (16, 24 giờ) Sau thời gian tiếp xúc với khí clo, đóng các đĩa petri đựng hạt và đƣa vào tủ cấy vơ trùng Mở đĩa cho khí clo bay tồn bộ ra ngồi trong 30 phút [111]
Khử trùng bằng dung dịch Javel
Hạt đậu tƣơng đƣợc khử trùng bằng cách ngâm vào dung dịch nƣớc Javel 50% (hàm lƣợng clo 38 g/l) trong các thời gian khác nhau 30, 40, 50 phút, sau đó
rửa sạch mẫu lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng [102][150]
Hạt sau khi khử trùng bởi các tác nhân đƣợc cấy trên mơi trƣởng rắn gồm khống MS, vitamin B5, pH 5,6 [111][154] Các nghiệm thức đƣợc thực hiện với 12 mẫu/bình mơi trƣờng, lặp lại 3 lần Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ hạt không nhiễm, tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm
2 2 3 Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm và một nửa hạt
Khảo sát ảnh hƣởng BA lên khả năng tạo chồi bất định của đốt lá mầm và một nửa hạt Qua đó xác định mơi trƣờng thích hợp kích thích tạo chồi
Phƣơng pháp khử trùng hạt áp dụng theo qui trình tối ƣu nhận đƣợc từ mục 2 2 2 Mẫu đốt lá mầm đƣợc chuẩn bị theo qui cách của Hinchee và cộng sự (1988), Olhoft và cộng sự (2003) [121][126] (QC 1) với các bƣớc gồm gieo hạt đậu trên môi trƣờng MS-vitamin B5 trong 5 ngày để hạt nảy mầm Sau đó, cây nảy mầm đƣợc loại bỏ phần rễ, giữ lại đoạn trụ dƣới lá mầm dài khoảng 3 -5 mm, liền với lá mầm Dùng dao mổ 15 tách rời hai lá mầm bằng cách chẻ dọc từ đốt đến hết đoạn trụ dƣới lá mầm, rồi loại bỏ chồi đỉnh, chồi bên Tiếp theo cắt nhẹ 7 lần theo phƣơng vng góc với trụ dƣới lá mầm để tạo vết thƣơng cho vùng mô phân sinh nách Mẫu đốt lá mầm gồm lá mầm, đoạn trụ dƣới lá mầm, vùng phân sinh nách, đƣợc dùng để cảm ứng chồi (hình 2 1)
Hình 2 1 Sơ đồ các bƣớc chuẩn bị mẫu đốt lá mầm
Mẫu một nửa hạt đƣợc chuẩn bị theo qui cách của Paz và cộng sự (2006) [111] (QC 2) với các bƣớc thực hiện gồm ngâm hạt đậu trong nƣớc cất vô trùng
khoảng 20 giờ Sau đó, tách đơi hai lá mầm dọc theo phần rốn hạt (hilum) Tiếp theo, loại bỏ trục phơi (hình 2 2)
Hạt đậu tƣơng Hạt đậu tƣơng ngâm
trong nƣớc 20 giờ cịn trục phơiMột nửa hạt Một nửa hạt đãloại trục phơi
Hình 2 2 Sơ đồ các bƣớc chuẩn bị mẫu một nửa hạt
Đốt lá mầm và một nửa hạt chuẩn bị theo các cách trên đƣợc đặt lên môi trƣờng tái sinh SI bổ sung BA (0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3) mg/l Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên Mẫu đƣợc ni trên kệ sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cƣờng độ 2 000 - 3 000 lux, nhiệt độ 25±2oC Ghi nhận kết quả sau 3 tuần
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu tái sinh chồi, số chồi tái sinh trung bình (số chồi tái sinh/số mẫu khảo sát), hình thái chồi bình thƣờng, đồng đều
Cụm chồi hình thành trên mơi trƣờng tạo chồi tối ƣu, đƣợc chuyển sang môi trƣờng tăng trƣởng thân SE Các chồi cao khoảng 3 cm đƣợc tách riêng và cấy lên môi trƣờng khảo sát tạo rễ
2 2 4 Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro
Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ IBA thích hợp kích thích tạo rễ cho chồi
in vitro để tạo cây con hoàn chỉnh
Chồi in vitro cao khoảng 3 cm đƣợc cấy lên mơi trƣờng khống MS, vitamin B5, 0,59 g/l MES, bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau (0; 0,5; 1; 1,5; 2) mg/l, PH 5,6 Ghi nhận kết quả sau 3 tuần nuôi cấy
Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên
Điều kiện ni cấy: mẫu đƣợc nuôi cấy trên kệ sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cƣờng độ 2 000 - 3 000 lux, nhiệt độ 25±2oC
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ chồi tạo rễ, số rễ trung bình (số rễ tạo thành/số mẫu khảo sát)
Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng
2 2 5 Ảnh hưởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt
Khảo sát ảnh hƣởng của PPT ở các nồng độ khác nhau lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm để xác định nồng độ thích hợp cho chọn lọc chồi chuyển gen
Đốt lá mầm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo chồi tối ƣu, bổ sung chất chọn lọc PPT ở các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 mg/l) Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên Mẫu đƣợc ni cấy trên kệ sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cƣờng độ 2 000 - 3 000 lux, nhiệt độ 25±2oC Ghi nhận kết quả sau 3 tuần
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu chết, khơng tái sinh, hình thái mẫu
2 2 6 Ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng của chồi in vitro
Khảo sát ảnh hƣởng của PPT, ở các nồng độ khác nhau, lên khả năng tạo rễ, phát triển của chồi in vitro, từ đó xác định nồng độ PPT thích hợp duy trì áp lực chọn lọc trong giai đoạn tạo rễ, phát triển cây in vitro
Chồi in vitro cao khoảng 3 cm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo rễ RM, bổ sung PPT ở các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/l) Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên Mẫu đƣợc ni cấy trên dàn sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cƣờng độ 2 000 - 3 000 lux, nhiệt độ 25±2oC Ghi nhận kết quả sau 3 tuần
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ chồi sống, phát triển, hình thái chồi
2 2 7 Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện nhằm xác định cách thức tạo vết thƣơng bằng kim châm thích hợp để vi khuẩn A tumefaciens xâm nhiễm, chuyển gen, đồng thời không ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh của mẫu Thu nhận đốt lá mầm từ cây nảy mầm 5 ngày tuổi theo phƣơng pháp của Hinchee và cộng sự (1988), Olhoft và cộng sự (2003) [121][126] Để tạo vết thƣơng, kim châm đƣợc sử dụng để đâm nhẹ (sâu khoảng 1 mm) lên vùng mơ phân sinh Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức, trong đó nghiệm thức đối chứng khơng sử dụng kim châm Số lần châm từ 1 đến 5 tƣơng ứng với các nghiệm thức còn lại Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần Thí
nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên Mẫu đƣợc ni cấy trên kệ sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cƣờng độ 2 000 - 3 000 lux, nhiệt độ 25±2oC Ghi nhận kết quả sau 3 tuần
Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu tái sinh chồi
2 2 8 Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương
Nghiên cứu chuyển gen vào đốt lá mầm đậu tƣơng dựa theo phƣơng pháp mô tả bởi Olhoft và cộng sự (2003) [126] Trong đó, mẫu đốt lá mầm đƣợc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp với xử lý sóng siêu âm nhằm tăng khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn, qua đó giúp nâng cao hiệu quả chuyển gen
Tạo vết thương vùng đốt lá mầm: Đốt lá mầm, từ cây nảy mầm 5 ngày tuổi
của giống MTĐ 176, đƣợc tạo vết thƣơng lên vùng mô phân sinh nách bằng cách dùng dao mổ 15 cắt nhẹ 5 lần theo phƣơng vng góc với trụ dƣới lá mầm Sau đó tiến hành xử l với sóng siêu âm trƣớc khi xâm nhiễm với vi khuẩn, thời gian xử l siêu âm lần lƣợt là: 0, 15, 30, 45, 60 giây
Chuẩn bị vi khuẩn cho thí nghiệm chuyển gen: vi khuẩn A tumefaciens mang
plasmid pCAMBIA3301 đƣợc ni cấy lắc qua đêm trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trƣờng Luria Bertani (LB) lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin nồng độ 50 mg/l ở 28oC, 220 vòng/phút (OD620nm = 0,8 – 1,0) Sau đó ly tâm thu phần lắng vi khuẩn ở 4000 vòng/phút, 10 phút, 22oC Hòa vi khuẩn trong 50 ml mơi trƣờng lây nhiễm IF, bổ sung acetosyringone 100 µM, lắc nhẹ khoảng 1 giờ trƣớc khi sử dụng xâm nhiễm mẫu
Gây nhiễm mô thực vật với vi khuẩn: mẫu thực vật sau khi tạo vết thƣơng
đƣợc ngâm vào dung dịch vi khuẩn đã pha lỗng trong 30 phút, sau đó thấm bớt dịch vi khuẩn trên mơ bằng giấy lọc vô trùng và cấy chuyển sang môi trƣờng đồng nuôi cấy với mặt trong của lá mầm tiếp xúc với môi trƣờng, ở nhiệt độ khoảng 24oC trong tối, thời gian 5 ngày Trên bề mặt môi trƣờng đặt một lớp giấy thấm để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn
Tái sinh chọn lọc chồi chuyển gen: Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu đƣợc
rửa loại bỏ vi khuẩn bám bên ngồi với mơi trƣờng SI lỏng bổ sung 500 mg/l cefotaxime Một nửa số mẫu sau khi đƣợc rửa sạch vi khuẩn sẽ đƣợc nhuộm GUS
để kiểm tra biểu hiện GUS tạm thời Một nửa số mẫu còn lại của mỗi nghiệm thức đƣợc cấy lên môi trƣờng tái sinh SI bổ sung kháng sinh cefotaxime 500 mg/l và nồng độ chất chọn lọc PPT tối ƣu từ các khảo sát trên Cấy chuyền mẫu sang môi trƣờng mới 2 tuần/lần Chồi hình thành sau 1 tháng trên mơi trƣờng SI đƣợc nhuộm GUS để kiểm tra hiệu quả chuyển gen
Nhuộm GUS mẫu chuyển gen: cho mẫu cần nhuộm GUS vào ống falcon 50
ml, thêm aceton 90% lạnh vào ngập mẫu Ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút Rửa mẫu bằng nƣớc lạnh Thêm dung dịch nhuộm GUS vào ngập mẫu Bọc kín và ủ qua đêm ở 37oC Sau đó, bỏ hết dung dịch nhuộm GUS và thay bằng cồn 96% ủ ở 65oC đến khi mất màu diệp lục Kiểm tra mẫu nhuộm GUS và ghi nhận bằng hình ảnh
Mỗi nghiệm thức gồm 40 mẫu, lặp lại 3 lần Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên
2 2 9 Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương
Thí nghiệm nhằm xác định thời gian tối ƣu xử l mẫu đốt lá mầm trong môi trƣờng áp suất âm để tăng khả năng chuyển gen
Phương pháp thực hiện: quá trình chuyển gen, chọn lọc chồi và nhuộm GUS
đƣợc thực hiện nhƣ thí nghiệm trên Tuy nhiên mẫu đốt lá mầm sau khi chuẩn bị từ cây nảy mầm, đƣợc ngâm trong dung dịch vi khuẩn A tumefaciens và đƣa vào môi trƣờng chân không ở -20 in Hg với các thời gian khác nhau: 0s, 15s, 30s, 45s, 60s thay vì sử dụng sóng siêu âm Thấm hút chân khơng đƣợc tạo ra bằng cách chuyển mẫu ngâm trong dung dịch vi khuẩn vào buồng hút chân không của máy bắn gen, thực hiện hút chân không đến áp lực - 20 in Hg, sau đó duy trì áp lực này với các khoảng thời gian nhƣ trên
Mỗi nghiệm thức gồm 40 mẫu, lặp lại 3 lần Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hồn tồn ngẫu nhiên
Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen