đốt lá mầm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện nhằm tối ƣu việc sử dụng kim châm để tạo vết thƣơng phù hợp cho nghiên cứu chuyển gen Kết quả ghi nhận đƣợc cho thấy đốt lá mầm của ba giống đậu tƣơng có đáp ứng khá giống nhau với sự tạo vết thƣơng của kim châm Ở nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức có số lần châm từ 1 đến 3, tỉ lệ mẫu tái sinh cao, khoảng 90% trở lên, giữa các nghiệm thức không khác biệt về thống kê Điều này cho thấy vùng đốt lá mầm bị tác động, tạo vết thƣơng nhƣng chƣa ảnh hƣởng lớn đến khả năng tái sinh Khi tăng số lần châm lên 4, 5 tỉ lệ mẫu tái sinh đã giảm đáng kể, đều dƣới 70% (bảng 3 10) Ở các nghiệm thức này vùng đốt lá mầm đã bị tổn thƣơng lớn hơn dẫn tới làm mất khả năng tái sinh ở nhiều mẫu (hình 3 11) Trong thí nghiệm chuyển gen, việc tạo vết thƣơng cho mẫu là yếu tố cần thiết giúp vi khuẩn A tumefaciens xâm nhiễm, chuyển đoạn T-DNA vào bộ gen tế bào thực vật [169][170][171] Tuy nhiên, gây tổn thƣơng quá mức sẽ dẫn đến vùng mô phân sinh bị dập nát, mất hoặc giảm khả năng phục hồi, tái sinh, từ đó giảm đáng kể hiệu quả chuyển gen Sử dụng kim châm 3 lần trong thí nghiệm này giúp gây tổn thƣơng đáng kể đến mẫu mơ, tuy nhiên mơ vẫn có khả năng phục hồi, tái sinh là điều kiện phù hợp để chuẩn bị mẫu mơ cho thí nghiệm chuyển gen, do đó đƣợc chọn cho các thí nghiệm tiếp theo
ảng 3 10 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của việc sử dụng kim châm lên khả năng tái
sinh của đốt lá mầm
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong phép thử Duncan Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x trước khi xử lý thống kê
Hình 3 11 Ảnh hƣởng của số lần châm đến khả năng tái sinh của
đốt lá mầm giống MTĐ 176
a châm 3 lần; b Châm 4 lần; c châm 5 lần
3 8 Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng (giống MTĐ 176)
Một nửa mẫu sau khi đồng nuôi cấy đƣợc rửa sạch vi khuẩn và nhuộm với dung dịch X-Gluc để kiểm tra biểu hiện tạm thời của gen gus
Kết quả nhuộm GUS tạm thời với đốt lá mầm sau 5 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn cho thấy tất cả các nghiệm thức đều có mẫu biểu hiện GUS+, tuy nhiên tỉ lệ mẫu và mức độ biểu hiện GUS có sự khác biệt Nhìn chung mức độ biểu hiện GUS tăng theo thời gian xử lý sóng siêu âm từ 0s đến 60s (bảng 3 11, hình 3 12)
Số lần châm
1 Tỉ lệ mẫu tái sinh (%)
MTĐ 176 HL 07-15 OMĐN 29 0 96,67 a 96,67 a 96,67 a 1 93,33 a 93,33 a 93,33 a 2 93,33 a 90,00 a 93,33 a 3 90,00 a 86,67 a 86,67 a 4 66,67 b 63,33 b 56,67 b 5 43,33 c 36,67 c 40,00 c
Ở nghiệm thức đối chứng khơng xử lý sóng siêu âm, tỉ lệ mẫu GUS+ (56,67%) và mức độ biểu hiện GUS đều khá thấp, chỉ xuất hiện một số đốm nhỏ màu xanh đặc trƣng Các nghiệm thức có xử lý mẫu bằng sóng siêu âm, tỉ lệ mẫu GUS+ và mức độ biểu hiện GUS đều tăng Sử dụng sóng siêu âm ở 15s làm tăng đáng kể biểu hiện GUS với 86,67% mẫu dƣơng tính Tăng thời gian siêu âm mẫu lên 30s, 45s, 60s tỉ lệ mẫu có GUS+ đều đạt tối đa 100%, đồng thời mức độ biểu hiện GUS, diện tích vùng nhuộm xanh cũng tăng cao Đặc biệt, ở các nghiệm thức xử lý mẫu với 45s và 60s, hầu hết toàn bộ mẫu đều nhuộm màu xanh đặc trƣng, cho thấy ảnh hƣởng của sóng siêu âm lên hầu hết các phần của mẫu
Kết quả trên thể hiện khả năng biểu hiện GUS tạm thời của mẫu sau 5 ngày đồng ni cấy với vi khuẩn Để đánh giá chính xác hơn ảnh hƣởng của xử lý sóng siêu âm đến hiệu quả chuyển gen cần xem xét thêm khả năng kháng chất chọn lọc, tái sinh tạo chồi trên môi trƣờng chọn lọc
Kết quả chọn lọc tái sinh chồi trên mơi trƣờng có 6 mg/l PPT nhƣ sau: nghiệm thức đối chứng nhận đƣợc 1 chồi kháng, có GUS+ (1 chồi/60 mẫu, 1,67%) Nghiệm thức xử lý 15s nhận đƣợc 4 chồi kháng trong đó 3 chồi có GUS+ (3 chồi/60 mẫu, 5%) Nghiệm thức xử lý 30s nhận đƣợc 7 chồi kháng trong đó 6 chồi có GUS+(6 chồi/60 mẫu, 10%) Nghiệm thức xử lý 45s và 60s, không nhận đƣợc chồi kháng PPT Trong q trình ni cấy trên mơi trƣờng tái sinh chọn lọc, ở các nghiệm thức xử lý sóng siêu âm từ 30s trở lên có hiện tƣợng mẫu bị nhiễm lại vi khuẩn, cụ thể tỷ lệ mẫu nhiễm lại ở các nghiệm thức nhƣ sau, nghiệm thức 30s: 16,67%; nghiệm thức 45s: 86,67%; nghiệm thức 60s: 100% Nhƣ vậy, khi tăng thời gian xử lý mẫu với sóng siêu âm có thể làm tăng mức độ biểu hiện GUS tạm thời, tuy nhiên mức độ tổn thƣơng của mẫu cũng gia tăng dẫn đến nhiều mẫu mất khả năng phục hồi, tái sinh và bị nhiễm lại vi khuẩn trong quá trình tái sinh chọn lọc
Với kết quả biểu hiện GUS tạm thời sau 5 ngày đồng nuôi cấy và chọn lọc chồi sau 4 tuần cho thấy xử lý mẫu với sóng siêu âm có khả năng giúp tăng hiệu quả chuyển gen vào đậu tƣơng, thời gian xử lý 30s đƣợc ghi nhận giúp tăng hiệu quả chuyển gen tối ƣu Khả năng tăng hiệu quả chuyển gen của sóng siêu âm là do sóng siêu âm gây nhiều vết thƣơng nhỏ trên bề mặt cũng nhƣ tạo những vết thƣơng sâu đến những lớp tế bào bên dƣới, đặc biệt là các tế bào phân sinh do đó giúp vi khuẩn A
tumefaciens tiếp xúc tốt hơn với các tế bào này tạo thuận lợi cho q trình chuyển
gen Ngồi ra, sóng siêu âm tạo rất nhiều vết thƣơng nhỏ cả trên và dƣới bề mặt mô, dẫn đến việc tiết nhiều hơn các hợp chất phenol tự nhiên từ mẫu thực vật, kích thích q trình chuyển gen của vi khuẩn A tumefaciens [172] Trên đậu tƣơng một số nghiên cứu cũng cho thấy khả năng tăng hiệu quả chuyển gen đáng kể khi sử dụng sóng siêu âm Các tác giả sử dụng loại mẫu khác nhau, tuy nhiên thời gian xử lý sóng siêu âm tối ƣu thƣờng khơng q dài, nhƣ với mơ có khả năng sinh phơi là 30s, lá mầm non (2s), đốt lá mầm (20s) [131][134][136]
ảng 3 11 Tỉ lệ mẫu dƣơng tính GUS khi xử l sóng siêu âm ở các thời gian khác nhau
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 dựa theo kiểm định thống kê LSD Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x trước khi xử lý thống kê
nh 3 12 Mẫu dƣơng tính GUS khi xử l sóng siêu âm ở các thời gian khác nhau a, b, c, d, e tương ứng với thời gian xử lý lần lượt: 0s; 15s; 30s; 45s; 60s f: chồi dương t nh sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc
Thời gian xử l sóng siêu âm (giây)
Tỉ lệ mẫu dƣơng tính 1 GUS (%) 0 56,67 a 15 86,67 b 30 100,00 c 45 100,00 c 60 100,00 c
3 9 Ảnh hƣởng của việc tạo vết thƣơng bằng dao mổ kết hợp thấm hút chânkhông lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tƣơng
Tƣơng tự nhƣ khảo sát trên, một nửa mẫu sau khi đồng nuôi cấy đƣợc rửa sạch vi khuẩn và nhuộm với dung dịch X-Gluc để kiểm tra biểu hiện tạm thời của gen gus Ở tất cả các nghiệm thức đều có mẫu biểu hiện GUS+, tuy nhiên tỉ lệ mẫu và mức độ biểu hiện GUS ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ ràng Nhìn chung khả năng chuyển gen, biểu hiện GUS tăng theo thời gian xử lý thấm chân không từ 0s đến 60s (bảng 3 12, hình 3 13)
Nghiệm thức đối chứng khơng xử lý thấm chân không, tỉ lệ mẫu GUS+(60%) và mức độ biểu hiện GUS đều khá thấp Trên mẫu chỉ xuất hiện một số đốm nhỏ màu xanh đặc trƣng (hình 3 13 a) Nhƣ vậy, có thể thấy khả năng chuyển gen vào mẫu trong trƣờng hợp này khá hạn chế
Các nghiệm thức có xử lý mẫu bằng thấm chân khơng, tỉ lệ mẫu GUS+ tăng từ 66,67 - 100%, đồng thời với mức độ biểu hiện GUS+ Kết quả biểu hiện GUS cao nhất với 100% mẫu GUS+, vùng mẫu nhuộm xanh cũng nhiều nhất, đạt đƣợc ở nghiệm thức xử lý mẫu trong môi trƣờng áp lực âm với thời gian 60s (hình 3 13 e)
nh 3 13 Mẫu dƣơng tính GUS khi xử l áp lực âm ở các thời gian khác nhau a, b, c, d, e tương ứng với thời gian xử lý lần lượt: 0s; 15s; 30s; 45s; 60s f: chồi dương t nh sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc
Kết quả trên thực hiện với mẫu đốt lá mầm sau thời gian đồng nuôi cấy 5 ngày với vi khuẩn, là kết quả biểu hiện GUS tạm thời, nhằm đánh giá mức độ tiếp xúc, thâm nhập, cũng nhƣ khả năng chuyển gen của vi khuẩn A tumefaciens vào
các tế bào của mẫu đốt lá mầm Tuy nhiên cần xem xét thêm khả năng kháng chất chọn lọc, tái sinh trên mơi trƣờng mới kết luận chính xác ảnh hƣởng của phƣơng pháp xử lý ở các nghiệm thức khác nhau tới hiệu quả chuyển gen
Kết quả tái sinh chồi trên môi trƣờng chọn lọc tƣơng đối phù hợp với kết quả nhuộm GUS tạm thời với mẫu đốt lá mầm Số lƣợng chồi kháng 6 mg/l PPT, có GUS+ nhận đƣợc ở các nghiệm thức nhƣ sau: Nghiệm thức đối chứng và xử lý chân không 15s nhận đƣợc 2 chồi kháng, tuy nhiên chỉ 1 chồi có GUS+(1 chồi/60 mẫu, 1,67%) Nghiệm thức xử lý với thời gian 30s và 45s nhận đƣợc 4 chồi kháng, trong đó 3 chồi có GUS+ (3 chồi/60 mẫu, 5%) Nghiệm thức xử lý với thời gian 60s nhận đƣợc 6 chồi kháng trong đó 5 chồi GUS+ (5 chồi/60 mẫu, 8,33%)
Nhƣ vậy ở cả kết quả biểu hiện GUS tạm thời sau 5 ngày đồng nuôi cấy và chọn lọc chồi sau 4 tuần đều cho thấy khả năng tăng hiệu quả chuyển gen đáng kể của xử lý thấm chân không, kết quả tối ƣu nhận đƣợc khi xử lý mẫu với thời gian 60s
ảng 3 12 Tỉ lệ đốt lá mầm dƣơng tính GUS khi xử l áp lực âm ở các thời gian
khác nhau
Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 theo kiểm định thống kê LSD Số liệu (1) đã được chuyển đổi sang dạng arcsin√x trước khi xử lý thống kê
Khả năng tăng hiệu quả chuyển gen bằng xử lý thấm chân không là do khi ngâm mẫu trong dung dịch vi khuẩn A tumefaciens, đƣợc đặt trong mơi trƣờng có áp suất giảm dần, dẫn đến các chất khí bên trong mẫu thốt ra ngồi Sau đó tăng áp suất đột ngột, làm cho dung dịch vi khuẩn xâm nhập thay thế những khí đã thốt ra Việc này làm tăng mức độ tiếp xúc của vi khuẩn A tumefaciens với những tế bào ở lớp bên trong mô thực vật, tạo thuận lợi hơn cho quá trình chuyển gen so với khi vi
Thời gian xử l thấm chân không (giây)
1 Tỉ lệ mẫu dƣơng tính GUS (%)
0 60,00 a
15 66,67 a
30 80,00 b
45 88,33 b
khuẩn chỉ bám trên lớp biểu mơ bên ngồi Trên đậu tƣơng, nhiều nghiên cứu chuyển gen sử dụng các loại mẫu khác nhau (lá mầm non, đốt lá mầm) đã ghi nhận xử lý thấm hút chân không giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium [133][134] Ngoài ra, nghiên cứu trên các đối tƣợng khác nhƣ: lúa mì, lúa gạo, cà phê, cà rốt cũng cho thấy kết quả tƣơng tự
[173][174][175][176] Nhƣ vậy, sử dụng thấm hút chân khơng trong qui trình chuyển gen có thể đƣợc áp dụng nhằm cải thiện, nâng cao hơn hiệu quả chuyển gen vào thực vật bằng vi khuẩn A tumefaciens
Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen 3 10 Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST Ly trích, kiểm tra plasmid pITB-AST từ E coli
Vi khuẩn E coli mang plasmid pITB-AST bảo quản ở -80oC đƣợc cấy vào đĩa petri chứa mơi trƣờng LB rắn có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin ở nồng độ 100 mg/l Sau hai ngày ủ, một số khuẩn lạc màu trắng, rời rạc xuất hiện, cấy chuyền một khuẩn lạc phát triển tốt vào mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/ml, lắc 220 vòng/phút qua đêm ở 37oC Dịch vi khuẩn phát triển tốt đƣợc sử dụng để ly trích plamid và kiểm tra bằng cách cắt bởi enzyme giới hạn tại một điểm (với EcoRI) hoặc 2 điểm (với EcoRI và HindIII)
Sản phẩm sau khi cắt đƣợc điện di trên gel agarose (hình 3 14) cho thấy sản phẩm cắt plasmid tại 1 điểm là một băng DNA có kích thƣớc khoảng 15,5 kb; sản phẩm cắt plasmid tại 2 điểm gồm 1 băng DNA có kích thƣớc khoảng 13,8 kb và 1 băng DNA có kích thƣớc khoảng 1,7 kb
Hình 3 14 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid ly trích từ E coli a: cắt plasmid tại một điểm, b: cắt plasmid tại hai điểm (L: thang chuẩn DNA- HindIII, 1, 2: plasmid được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn)
Từ các sản phẩm cắt tƣơng ứng với kích thƣớc thiết kế của plasmid pITB- AST, có thể khẳng định plasmid đƣợc kiểm tra là plasmid pITB-AST
Biến nạp plasmid pITB-AST vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 đƣợc thực hiện biến nạp plasmid pITB-AST và chọn lọc trên mơi trƣờng có bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin ở nồng độ 50 mg/l Kết quả thu đƣợc các dòng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens EHA 105 kháng kháng sinh tốt (hình 3 15)
2 mm
Hình 3 15 Các khuẩn lạc vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens biến nạp sau khi ủ
qua đêm trên mơi trƣờng có kháng sinh
Các dịng vi khuẩn kháng kháng sinh đƣợc ly trích plasmid và kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1, bằng kỹ thuật PCR với các mồi đặc hiệu
Sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel cho thấy có sự hiện diện của băng khuếch đại DNA với kích thƣớc 400 bp (hình 3 16) phù hợp với kích thƣớc mục tiêu của gen hbfd1 trên plasmid pITB-AST Kết quả này khẳng định các dòng vi khuẩn kháng đã biến nạp thành cơng plasmid pITB-AST và có thể sử dụng để chuyển gen vào đậu tƣơng
L 1 2 3
400 bp
Hình 3 16 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen hbfd1 từ plasmid
của vi khuẩn E coli và A tumefaciens
L: Thang chuẩn DNA 1 kb (Promega), 1: plasmid từ E coli, 2: mẫu nước PCR, 3: plasmid từ A tumefaciens
3 11 Chuyển gen tạo cây đậu tƣơng có khả năng sản xuất astaxanthin chuyênbiệt ở hạt biệt ở hạt
Đậu tƣơng là cây trồng nhận đƣợc nhiều quan tâm trong nghiên cứu cải tạo, nâng cao chất lƣợng giống Các nghiên cứu chuyển gen mang nhiều đặc tính khác nhau vào giống cây trồng này đã đƣợc thực hiện bởi nhiều tác giả trên thế giới Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen vào đậu tƣơng còn thấp và phụ thuộc nhiều vào giống Trong nghiên cứu này, một số yếu tố giúp cải thiện hiệu quả tạo vết thƣơng, tăng khả năng tiếp xúc giữa vi khuẩn và mẫu đƣợc tối ƣu hóa nhằm nâng cao khả năng chuyển gen gồm sử dụng kim châm nhiều mũi, sóng siêu âm, thấm hút chân khơng
Kim châm nhiều mũi đƣợc nghiên cứu sử dụng tạo vết thƣơng để thay thế phƣơng pháp thông thƣờng dùng dao mổ Cách sử dụng kim châm đƣợc tối ƣu hóa dựa trên yếu tố kết hợp giữa khả năng tạo vết thƣơng và tần số tái sinh của mẫu đốt lá mầm So sánh hiệu quả chuyển gen của hai phƣơng pháp bằng số thể chuyển gen dƣơng tính Southern blot/số mẫu xử lý
Bên cạnh phƣơng pháp sử dụng kim châm, các phƣơng pháp tạo vết thƣơng tiềm năng khác cũng đƣợc nghiên cứu, gồm sử dụng dao mổ cắt nhẹ vùng mô phân sinh 5 lần kết hợp với sóng siêu âm hoặc thấm hút chân khơng Cách thức sử dụng sóng siêu âm hoặc thấm hút chân không đƣợc tối ƣu bằng cách đánh giá hiệu quả chuyển gen gus vào vùng đốt lá mầm với các thông số khác nhau Phƣơng pháp