siêu âm, thấm chân không tạo vết thương mẫu
3 11 2 1 Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương
Các khảo sát trên đã tối ƣu phƣơng pháp sử dụng sóng siêu âm, thấm hút chân khơng để xử lý, tạo vết thƣơng mẫu giúp nâng cao hiệu quả chuyển gen gus vào đốt lá mầm đậu tƣơng Các thông số này đƣợc áp dụng trong nghiên cứu chuyển gen tạo cây đậu tƣơng có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt Ngoài ra, bên cạnh đốt lá mầm, mẫu một nửa hạt cũng đƣợc sử dụng làm vật liệu chuyển gen nhằm so sánh hiệu quả tiếp nhận gen so với mẫu đốt lá mầm
Chọn lọc, tái sinh, tạo cây kháng PPT
Nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens sử dụng mẫu đốt lá mầm và một nửa hạt, trong đó có sự hỗ trợ của sóng siêu âm, thấm chân khơng đã tạo đƣợc một số dòng kháng PPT Cụ thể q trình từ sau khi đồng ni cấy đến khi chuyển cây ra vƣờn ƣơm nhƣ sau: Sau khi đồng nuôi cấy 5 ngày, hầu hết đốt lá mầm và một nửa hạt vẫn giữ đƣợc trạng thái tốt: mô chắc, không bị nhiễm quá nhiều khuẩn Mẫu sau đó đƣợc rửa và thấm ráo để loại bớt vi khuẩn và cấy lên môi trƣờng tái sinh chọn lọc SI 6 mg/l PPT Sau 2 tuần đầu, chất chọn lọc đã gây chết, ức chế tái sinh ở vùng mô phân sinh của nhiều mẫu, chuyển sang màu nâu đen, trong khi đó một số mẫu bắt đầu hình thành các cụm chồi nhỏ Cấy chuyền mẫu sang môi trƣờng SI mới, một số cụm chồi phát triển, tuy nhiên ở cuối giai đoạn tái sinh chọn lọc, nhiều cụm chồi không vƣơn cao, lá vàng, đen, cả cụm chồi chết dần Hiện tƣợng cụm chồi có thể hình thành, rồi chết dần trên mơi trƣờng chọn lọc có thể do những mơ lân cận trên lá mầm đã đƣợc biến nạp gen, đã chuyển hóa PPT ở vùng mơ phân sinh tiếp xúc giúp các mơ hình thành đƣợc chồi và sinh trƣởng đƣợc trong giai đoạn đầu khi cụm chồi chƣa phát triển lớn và chƣa bị tách rời Ngoài ra, các hợp chất thiol trong môi trƣờng đồng ni cấy cũng đƣợc ghi nhận tạo tính kháng lại chất chọn lọc PPT nên gia tăng khả năng tạo chồi cho mẫu không chuyển gen dƣới tác động của PPT [180] Sau 4 tuần trên môi trƣờng chọn lọc SI, chỉ một số ít
cụm chồi phát triển, đƣợc tách rời khỏi lá mầm và cấy chuyền sang môi trƣờng tăng trƣởng thân SE bổ sung 4 mg/l PPT
Đối với hai giống HL 07-15, OMĐN 29, tất cả cụm chồi cịn sót lại trên môi trƣờng SI đều chết dần và không nhận đƣợc cây chuyển gen
Đối với giống MTĐ 176, hầu hết các cụm chồi cũng chết dần, chỉ một số ít tiếp tục phát triển Các chồi này khi cao khoảng 3 cm đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng tạo rễ RM bổ sung 1 mg/l PPT Sau khoảng 3 - 4 tuần bộ rễ hình thành, cây đƣợc chuyển ra trồng ngồi vƣờn ƣơm (hình 3 21) Tần số tạo dòng kháng PPT đƣợc ghi nhận ở phƣơng pháp dùng dao mổ tạo vết thƣơng trên đốt lá mầm là 1/150 (0,67%), kí hiệu dịng là D1; phƣơng pháp tạo vết thƣơng kết hợp sóng siêu âm 30s là 3/150 (2%), kí hiệu dịng là D2, D3, D4; phƣơng pháp tạo vết thƣơng kết hợp thấm chân khơng 60s là 3/150 (2%), kí hiệu dịng là D5, D6, D7; và ở phƣơng pháp dùng mẫu một nửa hạt là 2/200 (1%), kí hiệu dịng là D8, D9
Các kết quả trên cho thấy sự kết hợp sóng siêu âm hoặc thấm chân khơng trong q trình tạo vết thƣơng cho mẫu đốt lá mầm đã giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen Điều này phù hợp với kết quả khảo sát chuyển gen gus cũng nhƣ nhiều
nghiên cứu chuyển gen khác thông qua vi khuẩn A tumefaciens
[131][133][134][173][176] Ngoài ra, chuyển gen vào mẫu một nửa hạt cũng đạt đƣợc tần số khá cao, cho thấy khả năng áp dụng của loại mẫu này để chuyển gen vào đậu tƣơng Mặc dù hai giống đậu tƣơng HL 07-15, OMĐN 29 có khả năng tái sinh tốt và có hình thành một số chồi kháng PPT trong các giai đoạn chọn lọc đầu, nhƣng cuối cùng không nhận đƣợc cây chuyển gen Giống MTĐ 176 đáp ứng chuyển gen tốt hơn, tất cả các phƣơng pháp đều nhận đƣợc cây chuyển gen Các cây đậu tƣơng kháng PPT phát triển khá tốt in vitro Các cây này sau khi kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển bằng PCR đều cho kết quả dƣơng tính Tuy nhiên, khi chuyển ra trồng ex vitro, trong số 9 cây chuyển gen, chỉ 5 cây D2, D3, D5, D8, D9 có khả năng thích nghi, phát triển, 4 cây khơng thể thích nghi và chết dần
1 cm
a 1 cm b 2 mm c
5 mm
d 1 cm e
Hình 3 21 Các bƣớc chuyển gen và tạo cây đậu tƣơng chuyển gen
a:cây nảy mầm sau 7 ngày; b: mẫu đốt lá mầm đồng ni cấy với vi khuẩn; c: chồi hình thành sau 4 tuần trên mơi trường SI bổ sung 6 mg/l PPT; d,e: chồi kéo dài trên môi trường SE bổ sung 4 mg/l PPT và tạo rễ trên môi trường RM
3 11 2 2 Kiểm tra sự hiện diện của gen biến nạp trên các dòng kháng PPT bằng phương pháp PCR
DNA đƣợc ly trích từ lá của các dòng kháng PPT đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng PCR nhằm kiểm tra sự hiện diện của các gen biến nạp trong bộ gen cây, DNA của cây không chuyển gen sử dụng làm đối chứng âm (N), plasmid pITB- AST đƣợc dùng làm đối chứng dƣơng (P)
Kiểm tra sự hiện diện của gen bar
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen
bar, kích thƣớc đặc trƣng là 500 bp Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3 22) nhƣ
sau:
Hình 3 22 Kiểm tra sự hiện diện của
gen bar ở các cây kháng PPT bằng PCR
L: thang chuẩn 1kb (Promega); P: đối chứng dương; N: cây đối chứng; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tương ứng các dòng chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Ở mẫu đối chứng dƣơng P (plasmid pITB-AST) và các cây chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9 đều có sự hiện diện của 1 băng DNA với kích thƣớc khoảng 500 bp khi so sánh với thang chuẩn (phù hợp với kích thƣớc đặc hiệu của đoạn DNA đƣợc khuếch đại là 500 bp), trong khi phản ứng PCR với mẫu đối chứng âm N (DNA của cây không chuyển gen) cho kết quả âm tính Do đó, có thể khẳng định có sự hiện diện của gen bar trong tất cả các dòng kháng PPT Sự biểu hiện của gen bar giúp các dịng này có thể tồn tại và phát triển trên mơi trƣờng có chất chọn lọc PPT
Kiểm tra sự hiện diện của gen cbfd2
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen
cbfd2, kích thƣớc đặc trƣng là 500 bp Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3 23)
nhƣ sau:
Ở mẫu đối chứng dƣơng P (plasmid pITB-AST) và các cây chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9 đều có sự hiện diện của 1 băng DNA với kích thƣớc khoảng 500 bp khi so sánh với thang chuẩn (phù hợp với kích thƣớc đặc hiệu của đoạn DNA đƣợc khuếch đại là 500 bp), trong khi phản ứng PCR với mẫu đối chứng âm N (DNA của cây khơng chuyển gen) cho kết quả âm tính Do đó, có thể khẳng định có sự hiện diện của gen cbfd2 trong tất cả các cây D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Hình 3 23 Kiểm tra sự hiện diện của
gen cbfd2 ở các cây kháng PPT bằng PCR
L: thang chuẩn 1kb (Promega); P: đối chứng dương; N: cây đối chứng; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tương ứng các dòng chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen
hbfd1, kích thƣớc đặc trƣng là 400 bp Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3 24)
Hình 3 24 Kiểm tra sự hiện diện của gen hbfd1 ở các cây kháng PPT bằng PCR L: thang chuẩn 1kb (Promega); P: đối chứng dương; N: cây đối chứng; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tương ứng các dòng chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Ở mẫu đối chứng dƣơng P (plasmid pITB-AST) và các cây chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9 đều có sự hiện diện của 1 băng DNA với kích thƣớc khoảng 400 bp khi so sánh với thang chuẩn (phù hợp với kích thƣớc đặc hiệu của đoạn DNA đƣợc khuếch đại là 400 bp), trong khi phản ứng PCR với mẫu đối chứng âm N (DNA của cây khơng chuyển gen) cho kết quả âm tính Do đó, có thể khẳng định có sự hiện diện của gen hbfd1 trong tất cả các cây D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Kiểm tra sự hiện diện của gen Zm-psy
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen
Zm-psy, kích thƣớc đặc trƣng là 446 bp Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3 25)
nhƣ sau:
Hình 3 25 Kiểm tra sự hiện diện
của gen Zm-psy ở các cây kháng PPT bằng PCR
L: thang chuẩn 1kb (Promega); P: đối chứng dương; N: cây đối chứng; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tương ứng các dòng chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Ở mẫu đối chứng dƣơng P (plasmid pITB-AST) và các cây chuyển gen giả định D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9 đều có sự hiện diện của 1 băng DNA với kích thƣớc khoảng 446 bp khi so sánh với thang chuẩn (phù hợp với kích thƣớc đặc hiệu của đoạn DNA đƣợc khuếch đại là 446 bp), trong khi phản ứng PCR với mẫu đối chứng âm N (DNA của cây khơng chuyển gen) cho kết quả âm tính Do đó, có thể khẳng định có sự hiện diện của gen Zm-psy trong tất cả các cây D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9
Nhƣ vậy, kết quả PCR sử dụng các cặp mồi chuyên biệt cho gen bar, hbfd1,
cbfd2, Zm-psy đã giúp khẳng định các dòng kháng PPT chọn lọc đƣợc đều mang gen
biến nạp Tuy nhiên đây chỉ là kết quả bƣớc đầu, do đó cần tiếp tục phân tích Southern blot, đánh giá kiểu hình cây chuyển gen, định tính, định lƣợng chất mục tiêu
3 11 2 3 Kiểm tra cây chuyển gen bằng Southern blot
Phân tích Southern blot gen cbfd2
Thơng qua phân tích bằng PCR đã xác định đƣợc các cây đậu tƣơng chuyển gen Tuy nhiên để kiểm tra sự hòa nhập bền vững của các gen này vào bộ gen của cây, đồng thời xác định dịng chuyển gen riêng biệt, phân tích Southern blot, dựa trên lai phân tử với mẫu dị là đoạn trình tự của gen cbfd2 có kích thƣớc 500 bp đã đƣợc hiện DNA tổng số của các dịng chuyển gen, đối chứng âm (cây khơng chuyển gen), đối chứng dƣơng (plasmid pITB-AST) đƣợc cắt bởi enzyme HindIII
Kết quả trên hình 3 26 cho thấy ở đối chứng dƣơng có hiện băng lai, đối chứng âm khơng hiện băng lai Ở vị trí các dịng chuyển gen đều hiện diện băng lai với các kích thƣớc khác nhau Điều này chứng tỏ gen biến nạp đã đƣợc gắn chèn vào bộ gen cây ở những vị trí khác nhau, do đó các dịng này là các dòng chuyển gen riêng biệt Ngồi ra, ở dịng D3 chỉ hiện diện một băng lai, cho thấy dịng này chỉ có một bản sao của gen đƣợc gắn chèn vào bộ gen Các dòng còn lại đều có sự hiện diện từ 2-3 băng lai, chứng tỏ các dòng này đƣợc gắn chèn nhiều bản sao của gen vào bộ gen
Nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens thƣờng tạo ít bản sao của gen biến nạp trong bộ gen cây Do đó ít ảnh hƣởng đến các tính trạng vốn có của cây chuyển gen Hơn nữa việc có ít bản sao, tốt nhất là chỉ một bản sao của gen, giúp dễ chọn lọc dịng đồng hợp tử Dịng này sẽ có sự di truyền và biểu hiện
gen ổn định hơn qua nhiều thế hệ Trong 5 dịng chuyển gen đƣợc phân tích, có 2 dịng có 1 bản sao (D3, D5), 2 dịng có 2 bản sao (D2, D8) và 1 dịng có 3 bản sao (D9) Nhƣ vậy, nhìn chung các cây chuyển gen nhận đƣợc có số lƣợng bản sao của gen chuyển trong bộ gen không quá nhiều Tuy nhiên, để biết ảnh hƣởng của việc gắn chèn các bản sao này đến kiểu hình, sự sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ khả năng sinh sản, cần có các đánh giá ở giai đoạn sau
Hình 3 26 Kết quả phân tích DNA cây đậu tƣơng chuyển gen bằng Southern blot L Thang chuẩn HindIII; P Đối chứng dương plasmid pITB-AST; N Cây đậu tương không chuyển gen; D2, D3, D5, D8, D9 Các dòng cây đậu tương dương t nh PCR
3 11 2 4 Kiểm tra tính kháng của cây chuyển gen với thuốc diệt cỏ Basta
Gen chọn lọc bar giúp chọn lọc đƣợc chồi, cây chuyển gen in vitro, đồng thời cũng giúp cây chuyển gen ex vitro kháng với thuốc diệt cỏ gốc glufosinate [112][130][178] Do đó, thí nghiệm kiểm tra tính kháng của cây chuyển gen ngồi vƣờn ƣơm với thuốc diệt cỏ có thể làm cơ sở khẳng định sự hiện diện, biểu hiện của gen bar nói riêng cũng nhƣ góp phần dự đốn sự hiện diện, hoạt động của các cấu trúc gen đi kèm trong đoạn T-DNA Dung dịch thuốc diệt cỏ Basta (100 mg/l glufosinate) đƣợc sử dụng để quét lên mặt trên lá của các cây chuyển gen (D2, D3, D5, D8, D9) và đối chứng cấy mơ trồng ngồi vƣờn ƣơm Kết quả đƣợc ghi nhận sau 7 ngày cho thấy lá của các cây chuyển gen hầu nhƣ không bị ảnh hƣởng, vẫn giữ đƣợc màu xanh của diệp lục, trong khi đó lá của cây đối chứng bị mất màu xanh, cháy khơ tại vùng qt Basta (hình 3 27) Điều này cho thấy gen kháng thuốc diệt cỏ bar gắn chèn trong bộ gen của các cây chuyển gen đã biểu hiện giúp cây kháng lại thuốc diệt cỏ ở nồng độ gây chết với cây đối chứng
1 cm
a b
Hình 3 27 Lá cây đối chứng và chuyển gen sau 7 ngày quét dung dịch Basta a: lá cây đối chứng; b: lá cây chuyển gen
3 11 2 5 Kiểm tra sự di truyền của gen biến nạp
Trong 9 dòng đậu tƣơng chuyển gen đƣợc kiểm tra bằng PCR trồng trong vƣờn ƣơm, chỉ 5 dịng có khả năng thích nghi, phát triển Các dịng này cũng biểu hiện tính kháng với thuốc diệt cỏ Basta (100 mg/l glufosinate) và có sự hiện hiện các băng lai đặc hiệu trong thí nghiệm Southern blot với probe là đoạn gen cbfd2 Trong các dịng này, chỉ 2 dịng (D2, D8) có sự tạo hoa, trái, hình thành hạt (hình 3 28), 3 dịng cịn lại (D3, D5, D9) không tạo trái, mà sau một thời gian phát triển lá vàng, rụng, cây chết dần Một số nghiên cứu chuyển gen trên đậu tƣơng cũng ghi nhận nhiều cây chuyển gen khi trồng trong vƣờn ƣơm khơng thể tạo hạt [130][181] Ngun nhân có thể do rễ những dịng chuyển gen này kém phát triển ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển chung, ngoài ra vị trí gắn chèn của gen biến nạp cũng có thể gây ảnh hƣởng đến khả năng sống của giao tử [181][182]
Sau khoảng 4 tháng phát triển trong vƣờn ƣơm, trái của 2 dịng D2 và D8 đến giai đoạn chín, vỏ trái khơ, màu vàng Dòng D2 thu đƣợc hai trái, mỗi trái 1 hạt, gồm 1 hạt màu đỏ (D2-1) và 1 hạt màu trắng (D2-2) Dòng D8 thu đƣợc 1 trái hai hạt, gồm 1 hạt đỏ (D8-1) và 1 hạt trắng (D8-2) Màu đỏ của các hạt thể hiện đậm và rõ ở phần rễ mầm, nhạt hơn ở phần phơi nhũ (hình 3 29) Nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin trên nhiều cây khác nhau cho thấy sự tích lũy astaxanthin trên các bộ phận của cây chuyển gen dẫn đến màu của các bộ phận này chuyển sang đỏ nhƣ ở thuốc lá, táo, ngô, cà chua,… [7][31][60][62]
Bốn hạt của hai dòng D2 và D8 đƣợc gieo trồng trong vƣờn ƣơm để kiểm tra khả năng nảy mầm, sinh trƣởng, phát triển của cây so với đối chứng Trƣớc tiên, các hạt chuyển gen và đối chứng đƣợc gieo nảy mầm trong đĩa petri có giấy thấm nƣớc, ủ trong tối 4 ngày đến khi phần rễ mầm phát triển tốt Sau đó, cây mầm đƣợc trồng trong chậu đất ở vƣờn ƣơm