CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.5. Ứng dụng công nghệ nano làm chất dẫn truyền thuốc chống ung thư
Trong y khoa hiện đại, các nhà khoa học ln tìm kiếm các vật liệu dẫn truyền thuốc mới nhằm cải thiện khả năng phân phối thuốc đồng thời tăng tác dụng của thuốc và tăng hiệu quả chữa bệnh. Chất nano dẫn truyền thuốc phải được tổng hợp dựa trên 3 tiêu chí sau:
Giảm độ chuyển hóa của thuốc
Giảm độ độc của cả hệ thống và dẫn truyền thuốc đúng mục tiêu
Trong vài thập kỹ qua, nghiên cứu trong lĩnh vực nano dẫn truyền thuốc đang được chú ý. Hệ thống hạt nano dẫn truyền thuốc được biến tính nhằm cải thiện các tính chất dược động lực học và dược tính của các loại phân tử thuốc[2].
Theo hệ thống phân phối thuốc, các hạt nano có thể ngậm thuốc hay phân tử sinh học thành những cấu trúc bên trong của chúng hoặc hấp phụ thuốc hoặc phân tử sinh học lên các bề mặt bên ngồi của chúng [44].
Kích thước hạt và đặc điểm bề mặt có thể được thao tác dễ dàng để đạt được cả hai mục tiêu thụ động và chủ động của thuốc sau khi đưa thuốc vào cơ thể.
1.5.1. Cơ chế mang thuốc hướng đích thụ động:
Khi thuốc được đưa vào cơ thể, hệ dẫn thuốc nano sẽ theo hệ thống tuần hoàn qua mạch máu để đi đến mục tiêu là tế bào bệnh. Kích cỡ hạt nano là yếu tố quan trọng cho việc mang thuốc, kích cỡ này phải trong phạm vi từ 10 đến 200 nm. Nếu nhỏ hơn 10 nm thì hạt có thể sẽ bị thải ra theo đường bài tiết hoặc chui vào các khe hở lớp nội mô thành mạch máu tế bào bình thường. Nếu lớn hơn 200 nm, hạt sẽ khơng khuyếch tán được qua thành mạch máu và sẽ bị đào thải ra ngoài theo cơ chế miễn dịch. Vậy cơ chế này vận dụng sự khác biệt giữa vùng mô thường và mô ung thư nghĩa là nhờ hiện tượng tăng tính thấm và tăng hiệu quả lưu giữ (Enhanced permeability and Retention Effect – EPR) [45].
1.5.2. Cơ chế mang thuốc hướng đích chủ động:
Giữa tế bào ung thư và tế bào lành có 3 yếu tố khác nhau cơ bản: tế bào ung thư có độ pH thấp (pH khoảng 4-5), có nhiệt độ cao (38-40oC) và trên bề mặt có nhiều loại vitamin (nhiều nhất là nhóm B9), trong khi đó tế bào thường có pH (7,2-7,4) và nhiệt độ (36-37oC). Vậy để tạo hạt nano mang thuốc chủ động ta nên biến tính hạt tạo thành các nhóm chức năng đặc biệt hướng đến tế bào ung thư. Chẳng hạn như tế bào ung thư có ái lực với acid folic nên thường gắn acid folic làm tác nhân hướng đích chủ động [45].
Vị trí dẫn truyền thuốc vào mục tiêu cụ thể có thể đạt được bằng cách gắn các phối tử mục tiêu lên bề mặt hạt nano mang thuốc hoặc sử dụng các chất có từ tính.
Ưu điểm của phân phối thuốc qua trung gian cấu trúc nano bao gồm khả năng để cung cấp các phân tử thuốc trực tiếp vào các tế bào và khả năng nhắm mục tiêu các khối u trong mô khỏe mạnh.
1.5.3. Những nghiên cứu của vật liệu nano silica trong lĩnh vực dẫn truyền thuốc
Vật liệu nano silica xốp thể hiện những đặc điểm riêng biệt khiến chúng trở thành vật mang nano lý tưởng để lưu trữ, bảo vệ và vận chuyển thuốc đến vị trí mục tiêu. Một thách thức quan trọng khác là tránh tình trạng giải phóng thuốc quá sớm trước khi đạt mục tiêu là tế bào ung thư. Theo cách này, các lỗ của vật liệu nano silica xốp có thể được giới hạn bằng cách sử dụng những chất giữ thuốc lại.
Một trong những lợi thế của nano silica xốp là có thể dễ dàng biến tính để giữ thuốc trong lỗ xốp và mang thuốc đến đúng tế bào ung thư, giải phóng đúng vị trí và kiểm sốt liều lượng một cách tinh tế dựa trên cơ chế giải phóng nhạy pH[47]. Các tác nhân hydrazine, chitosan, gelatin là những chất có khả năng năng tạo liên kết hydrazon, imine với thuốc và rất nhạy pH nhả thuốc đúng mục tiêu.
Các hạt nano silica đã tạo ra một cuộc cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu hệ thống phân phối và dẫn truyền thuốc hướng đích. Kể từ năm 2001, Vallet-Regí và các cơng sự của ông [48] lần đầu tiên đã chế tạo ra vật liệu MSNs (nano silica xốp còn gọi là PNS-porous nano silicas) đa chức năng để điều trị các bệnh lý đa dạng. Theo khảo sát của Vallet-Regí, người tiên phong nghiên cứu vật liệu nano silica xốp ứng dụng trong y sinh, cho biết vật liệu nano silica xốp đã cho ra đời những thành tựu nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực dẫn truyền thuốc đáng kể từ năm 2001 cho đến nay [47].
Việc đưa nanomedicine vào lĩnh vực này được kỳ vọng sẽ thay đổi tương lai gần của ngành dược phẩm và công nghệ sinh học. Công cụ công nghệ nano mới này sẽ khắc phục được những hạn chế lớn của y học thơng thường như độ hịa tan và độ ổn định thấp, thiếu tính đặc hiệu và cấu hình dược động học khơng đầy đủ và tác dụng phụ nghiêm trọng của thuốc [49]. Mặc dù trong vài thập kỷ qua, việc đưa vật liệu nano vào y học đã cung cấp hơn 250 sản phẩm đã được phê duyệt hoặc đang trải qua các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng khác nhau, ứng dụng lâm sàng cuối cùng của chúng vẫn là một thách thức lớn [50].
Hình 1.12. Thành tựu nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực dẫn truyền thuốc[47].
1.6. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
1.6.1. Tổng hợp nanosilica xốp và tạo cầu nối biến tính
1.6.1.1. Tổng hợp vật liệu nano silica xốp bằng phương pháp sol-gel
Nano silica xốp (porous nano silicas) được tổng hợp bằng phương pháp sol-gel sao cho kích thước hạt đồng đều dưới 100 (nm). Với kích thước này hạt nano sau khi biến tính hồn tồn có khả năng xâm nhập vào các thành mạch máu và màng tế bào để giải phóng.
Phương pháp sol-gel là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng để tạo ra một số vật liệu có kích thước ở cấp độ nano. Q trình này thường liên quan đến những phân tử alkoxide kim loại mà chúng sẽ bị thủy phân trong điều kiện được kiểm sốt.
Phản ứng thủy phân thay thế nhóm alkoxide (–OR) trong liên kết kim loại – alkoxide bằng nhóm hydroxyl (–OH) để tạo thành liên kết kim loại –hydroxyl.
Hình 1.13. Cơ chế phản ứng thủy phân và ngưng tụ.
Trong phản ứng thủy phân, các nhóm alkoxide (–OR) trong liên kết kim loại – alkoxide được thay thế bằng nhóm hydroxyl (–OH) của môi trường để tạo thành liên kết kim loại – hydroxyl. Trong khi đó, phản ứng ngưng tụ tạo nên liên kết kim loại – oxide – kim loại, đây là cơ sở cấu trúc cho các màng oxide kim loại. Hiện tượng ngưng tụ diễn ra liên tục làm cho liên kết kim loại–oxi–kim loại không ngừng tăng lên đến khi tạo ra một mạng lưới trong khắp dung dịch.
Sử dụng chất hoạt động bề mặt Cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) như một tác nhân định hình cấu trúc lỗ xốp cho vật liệu nano, đây cũng có thể xem là khung sườn để TEOS có thể thủy phân và bao lấy tạo điều kiện cho việc hình thành các hạt nano silica xốp sau này, các hạt nano silica xốp được tạo ra với mong muốn có thể mang thuốc được nhiều hơn nhờ vào cấu trúc lỗ xốp của vật liệu [51].
1.6.1.2. Tạo cầu nối biến tính
Như đã trình bày, việc biến tính bề mặt vật liệu nano silica nhằm tăng hoạt tính sinh học, nâng cao hiệu quả mang thuốc, kéo dài thời gian lưu thơng thuốc và giải phóng tại đúng mục tiêu.
Để thuận lợi cho việc biến tính, chúng ta thường tạo cầu nối trước khi biến tính. Chất làm cầu nối thường có một đầu tạo liên kết hóa học với nhóm OH trên bề mặt nano silicas và đầu cịn lại thường mang nhóm có hoạt tính mạnh dễ dàng tạo phản ứng với các chất biến tính. Trong đề tài chúng tơi chọn (3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) và (3- aminopropyl)triethoxysilane (APTES) làm cầu nối.
Tổng hợp PNS-GPTMS
Hình 1.14. Cấu trúc (3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane
Nhóm epoxide hoạt động hóa học rất tốt và nó có khả năng tham gia nhiều phản ứng. Bởi vì glycidyl ether có chứa nhóm epoxide nên nó được ứng dung rất nhiều trong hóa sinh. Khi tồn tại ion H+, vịng epoxide sẽ bị ion hóa, hoạt tính mạnh sẽ tham gia phản ứng với các tác nhân thân hạch (ái nhân). Vòng epoxide bị bẻ gãy và kết quả là hình thành nhóm alcol.
Với các acid hữu cơ, các alcol được hình thành sau đó là phản ứng ester hóa diễn ra. Các phenol phản ứng để tạo ra nhóm alcol và vịng thơm được gắn vào thông qua liên kết ether.
Một vài chất ái nhân (thân hạch) có thể phản ứng trên epoxide, kết quả là vòng này bị bẻ gãy và nguyên tử oxy trở nên rất thân hạch.
Vòng epoxide còn được biết như là một trong những tác nhân alkyl hóa hoặc là tác nhân thân điện tử, bởi việc hình thành ion carbonium, ion này có thể phản ứng với các tác nhân thân hạch (ái nhân).
Hình 1.15. Phản ứng tạo cầu nối GPTMS trên nano silica xốp (PNS-GPTMS).
Giai đoạn này có thể xem là giai đoạn hoạt hóa hạt silica, bởi ngồi những thuận lợi của cầu nối epoxy thì GPTMS khơng gây độc cho cơ thể và phản ứng của nó lên bề mặt silica là rất êm dịu, tránh được những biến đổi bề mặt không cần thiết trên hạt silica.
Tổng hợp PNS-APTES
Các hạt nano PNS-APTES cũng được tổng hợp bằng phương pháp sol-gel, sử dụng APTES như nguồn cung cấp -NH2 cho bề mặt hạt nano silica xốp.
Ban đầu sử dụng CTAB như một tác nhân tạo khung sườn để TEOS thủy phân và ngưng tụ để tạo thành các hạt nano silica xốp, các hạt nano silica xốp được tạo ra và tiếp tục được gắn APTES với mục đích làm cầu nối cho giai đoạn biến tính với Gelatin
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp bao gồm nhiệt độ, tốc độ khuấy, xúc tác. Tuy nhiên, để đạt được kích thước mong muốn như trên thì phản ứng này nên được
tiến hành ở 60C, xúc tác NH3 với nồng độ 2,8%, cũng như tốc độ khuấy khoảng 350 vịng/phút.
Hình 1.16. Phản ứng tạo cầu nối APTES trên nano silica xốp (PNS-APTES).
1.6.2. Biến tính vật liệu nano silica xốp (PNS)
1.6.2.1. Biến tính PNS bằng Hydrazine (tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazine là chất mang thuốc 1)
Nhằm mục đích tạo nên nhóm hydrazine trên bề mặt nanosilica xốp và dựa trên liên kết hydrazone bền với doxorubicin tại mơi trường trung tính. Chất mang sẽ mang thuốc đến đúng tế bào ung thư (có pH kém) mới giải phóng, tăng hiệu quả của phương pháp hóa trị.
Hình 1.17. Phản ứng biến tính nano silica xốp(PNS) bằng hydrazine
1.6.2.2. Biến tính PNS bằng Chitosan-mPEG (tổng hợp PNS-GPTMS-CS-mPEG là chất mang thuốc 2) mang thuốc 2)
Tổng hợp Chitosan-mPEG
Qui trình tiến hành gồm 2 bước, đầu tiên hoạt hóa mPEG bằng p-nitrophenyl carbonate (NPC) trước sau đó mới tổng hợp chitosan-mPEG
Hoạt hóa mPEG bằng p-nitrophenyl carbonate (NPC)
Phản ứng thế ái nhân (thân hạch) trên carbon của nhóm carbonyl diễn ra thuận lợi ở nhiệt độ 65C.
Hình 1.18. Phản ứng tổng hợp mPEG-p-nitrophenyl carbonate
Tổng hợp Chitosan-mPEG
Trong phản ứng này, do chitosan có cấu trúc khá lớn nên ảnh hưởng lập thể, vì vậy phải dùng dư chitosan so với dự kiến để đảm bảo sản phẩm tạo thành có nhiều liên kết amide nhất.
Phương trình phản ứng:
Hình 1.19. Phản ứng tổng hợp chitosan-mPEG Tạo liên kết giữa PNS-GPTMS và CS-mPEG mPEG Tạo liên kết giữa PNS-GPTMS và CS-mPEG
Phản ứng của chitosan lên bề mặt của nano silica vừa biến tính hồn tồn có thể tạo ra nhờ khả năng hoạt động mạnh của vòng epoxy trong pH cao lẫn pH thấp. Tuy nhiên để chọn lựa pH như thế nào để CS-mPEG vẫn cịn giữ được liên kết amide của mình sau phản ứng là vấn đề đáng chú ý.
Trong nghiên cứu này, pH khoảng 3 đến 4 được lựa chọn, vì ở pH này liên kết amide này khơng bị thủy phân.
Hình 1.20. Phản ứng biến tính nano silica bởi Chitosan-mPEG.
1.6.2.3. Biến tính PNS bằng Gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE là chất mang 4) Tổng hợp PNS-APTES- AnhydrideSuccinic 4) Tổng hợp PNS-APTES- AnhydrideSuccinic
Nhằm để biến tính hiệu quả hạt silica, luận án tiến hành gắn nhóm COOH lên bề mặt hạt nano PNS-APTES bằng cách cho PNS-APTES phản ứng với anhydride succinic trong dung mơi aceton
Hình 1.21. Phản ứng tạo gắn anhidride succinic lên PNS (PNS-APTES-COOH)
Khi cho bề mặt của hạt silica có nhóm amino phản ứng với anhydride succinic trong điều kiện lạnh và pH khoảng 6–7 và dung môi DMF. Phản ứng diễn ra theo cơ chế mở vòng anhydride succinic. Đầu tiên, đơi điện tử của nhóm amino sẽ tác kích vào nhóm carbonyl, tiếp theo là sự di chuyển proton từ nitrogen đến oxygen của vòng tạo ra liên kết của amino và hình thành nhóm -COOH bên ngồi bề mặt hạt.
Tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE
Để q trình biến tính đạt hiệu suất cao cho quá phản ứng biến tính nano silica cần hoạt hóa nhóm -COOH của PNS-APTES-COOH trước bằng 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC):
Hình 1.22. Phản ứng hoạt hóa PNS-APTES-succinic bằng EDC.
Sau khi tiến hành hoạt hóa sẽ thực hiện q trình biến tính PNS-APTES-succinic với gelatin. Q trình tạo liên kết PNS-APTES-Succinic với gelatin theo phản ứng sau:
Hình 1.23. Phản ứng tạo liên kết PNS-APTES-Anhydride succinic với gelatin1.6.2.4. Biến tính PNS bằng Gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-GEL-mPEG hay cịn gọi là 1.6.2.4. Biến tính PNS bằng Gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-GEL-mPEG hay cịn gọi là PNS-APTES-GEL-mPEG là chất mang 5)
Tổng hợp Gelatin-mPEG
Nhằm mục đích tăng khả năng tan trong nước cũng như tăng tính tương hợp sinh học và duy trì thời gian thuốc lưu thông trong cơ thể, nghiên cứu này tiến hành gắn mPEG cho Gelatin trước khi biến tính lên bề mặt silica. Để tổng hợp được nano Gelatin-mPEG ta tiến hành 2 bước:
Hoạt hóa mPEG bằng p-nitrophenyl carbonate (NPC)
Phản ứng thế ái nhân (thân hạch) trên carbon của nhóm carbonyl diễn ra thuận lợi ở nhiệt độ 65C như phản ứng hình 2.6.
Phản ứng xảy ra theo cơ chế tương tự như phản ứng ester hóa. Trong cấu trúc của NPC, liên kết CO có tính chất khơng no và bị phân cực mạnh về phía oxygen, làm xuất hiện mật độ điện tích dương trên nguyên tử carbon, tạo ra trung tâm thiếu điện tử.
Trong khi đó trên nguyên tử oxygen của nhóm OH của phân tử mPEG cịn hai đơi điện tử tự do, nên ngun tử oxygen đóng vai trị như một tác nhân ái nhân (thân hạch). Trung tâm thiếu điện tử trên nguyên tử carbon của phân tử NPC gặp tác nhân ái nhân của phân tử mPEG sẽ tương tác với nhau tạo sản phẩm mPEG-NPC
Điều đáng chú ý là tác chất NPC và sản phẩm mPEG-NPC có hoạt tính rất mạnh, dễ bị thủy phân trong mơi trường nước, do đó để đạt được hiệu suất phản ứng cao thì phản ứng phải được thực hiện trong điều kiện khan nước, ở nhiệt độ thấp, trong mơi trường khí nitrogen; tác chất và dung môi phải được làm khan trước khi tiến hành phản ứng. Để hạn chế sự thủy phân sản phẩm tạo thành, sản phẩm thu được phải được sấy khơ trong tủ sấy chân khơng, bảo quản trong bình hút ẩm tránh ánh sáng và hơi ẩm trong khơng khí.
Phản ứng gắn gelatin với mPEG
Ban đầu mPEG được cho tác dụng với NPC để thu được mPEG-NPC. Tác chất này sau đó phản ứng với Gelatin để thu được sản phẩm Gelatin-mPEG.
Trong phản ứng này, do Gelatin có cấu trúc khá lớn nên ảnh hưởng lập thể, vì vậy phải pha lỗng Gelatin để đảm bảo sản phẩm tạo thành có nhiều liên kết amide nhất.
Phương trình phản ứng:
Tổng hợp PNS-APTES-Succinic-Ge-mPEG
Sau khi tiến hành hoạt hóa PNS-APTES- Anhydride succinic bằng EDC (hình 2.10), ta sẽ thực hiện phản ứng của PNS-APTES- Anhydride succinic với Gelatin-mPEG.
Hình 1.25. Phản ứng tạo liên kết PNS-APTES-Anhydride succinic với Gelatin-mPEG
Sau khi quá trình tổng hợp hồn thành, sản phẩm thu được sẽ là vật liệu có kích thước nano PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG (có thể gọi tắt là PNS-GEL-mPEG). Vật liệu này được tổng hợp với kích thước mong muốn là 20 nm < d < 100 nm, trong đó d là đường kính hạt. Ngồi ra vật liệu được tổng hợp sẽ có cấu trúc dạng tổ ong nên sẽ có nhiều lỗ xốp, nhờ vậy khi thực hiện q trình mang thuốc các hạt thuốc sẽ có thể được hấp phụ trên bề mặt vật