CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM
2.2. Thực nghiệm
2.2.3.1. Khảo sát quá trình mangthuốc 5-FU và giải phóngthuốc
Phương pháp 1[56]:
- Hòa tan riêng lẻ thuốc và chất mang vào nước khử ion thành 2 dung dịch riêng. Khuấy và siêu âm tạo 2 hỗn hợp cho đồng nhất trong khoảng 30 phút.
- Cho từ từ hỗn hợp thuốc vào chất mang. Duy trì khuấy từ trong khoảng thời gian cho thuốc vào. Tiếp tục khuấy trong 24 giờ.
- Tiến hành chia ra 6 màng để thẩm tách loại thuốc tự do.
- Đo HPLC để xác định thuốc chưa mang nhận thấy với phương pháp này không thể mang được thuốc 5-FU vào vật liệu nano silica dù đã thử nhiều lần với tất cả chất mang được biến tính, hút chân khơng cẩn thận chất mang trước khi mang thuốc…
Với khó khăn trên, chúng tơi tìm cách mang được thuốc 5-FU vào vật liệu bằng cách bắt chước nguyên lý của sắc ký cột, dùng áp lực nén thuốc vào chất mang. Phương pháp này xin tạm gọi là phương pháp 2.
Phương pháp 2:
- Cân 60 mg chất mang cho vào ống nhỏ giọt, (dùng muỗng inox nhỏ lấy chất mang cho vào ống nhỏ giọt).
- Cho cẩn thận 12 mL nước cất hòa tan 15 mg thuốc trong becher, khuấy từ trong 1giờ, lấy 1 mL để đo HPLC trước khi mang thuốc (dung dịch A), còn lại 11mL dung dịch A.
- Tiếp theo, cho dung dịch thuốc (dung dịch A) vào ống nhỏ giọt thủy tinh chứa sẵn chất mang, lấy 1 mL nước đề ion tráng chai đựng thuốc, cho chảy qua cột (ống nhỏ giọt ) trong 2 ngày (nên dùng thêm 1 ống nhỏ giọt khác lấy thuốc để tránh thất thoát).
- Hứng dung dịch qua cột (ống nhỏ giọt ) nhiều lần, thực hiện trong 2 ngày (dung dịch hứng được sau 2 ngày này gọi là dung dịch B).
- Sau đó lấy tồn bộ hỗn hợp chất mang và thuốc trong ống nhỏ giọt cho vào becher, khuấy hỗn hợp 30 phút với 20 mL nước khử ion
- Tiến hành chia ra 6 màng để thẩm tách loại thuốc tự do.
Đo HPLC để xác định thuốc chưa mang từ đó tính hiệu suất mang thuốc và khả năng chứa thuốc của vật liệu dựa trên công thức sau [56, 57]:
Hiệu suất mang thuốc (DLE)
DLE (%) =Lượng thuốc chứa trong mẫu
Tổng lượng thuốc ban đầu x 100%
Khả năng chứa thuốc của chất mang (DLC)
Lượng thuốc chứa trong mẫu DLC (%) =
Tổng lượng chất mang và lượng thuốc trong mẫux 100%
Khảo sát q trình giải phóng thuốc
Mẫu nano silica biến tính đã mang thuốc được sử dụng để khảo sát q trình giải phóng trong 2 mơi trường dung dịch đệm phosphat (pH 7,4) và đệm acetat (pH 4,5). Cách thực hiện như sau:
Mỗi túi thẩm tách chứa 2 mL hệ nano silica mang thuốc trên, tiến hành thẩm tách với 18 mL dung dịch đệm PBS và Acetat. Lấy mẫu trong thời gian 4 ngày theo thời gian 1giờ, 2 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 84 giờ và 96 giờ. Nồng độ 5-FU được giải phóng ra mơi trường được xác định bằng phương pháp HPLC.
Để đảm bảo kết quả tính được chính xác mẫu đo được lấy giá trị trung bình. Sau đó đo HPLC dung dịch A, B, và các chai đựng mẫu giải phóng.
Hình 2.15. Sơ đồ quy trình mang 5-FU2.2.3.2. Khảo sát khả năng mang và giải phóng DOX trên vật 2.2.3.2. Khảo sát khả năng mang và giải phóng DOX trên vật liệu Khảo sát tỉ lệ giữa thuốc DOX và chất mang [ 58 ]
Trước khi tiến hành mang thuốc, chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ giữa thuốc và chất mang sau đó chọn tỉ lệ tối ưu nhất để thực hiện mang thuốc cho các mẫu.
Pha dung dịch bao gồm 10mg chất mang với 10 mL nước cất và siêu âm hỗn hợp trong khoảng 30 phút.
Cho cẩn thận 2 mL nước cất hòa tan thuốc theo từng tỉ lệ. Trộn 2 dung dịch trên khuấy từ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.
Sau khi khuấy, lấy các dung dịch cho vào các túi thẩm tách 3.000-5.000 Da trong nước cất
Lấy dung dịch thẩm tách 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ để đo hàm lượng thuốc chưa mang.
Khảo sát quá trình mang thuốc DOX [ 35 , 51 , 58 ]
Tiến hành chuẩn bị dung dịch 1 bằng cách pha dung dịch bao gồm 60 mg chất mang PNS đã biến tính với 10mL nước cất và đánh siêu âm hỗn hợp trong khoảng 30 phút.
ta sẽ thu được dung dịch 2.
Tiếp theo cho cẩn thận dung dịch 2 vào dung dịch 1 và khuấy từ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi khuấy, lấy 2mL dung dịch để đo nồng độ ban đầu.
Sau đó cho mẫu còn lại vào 3 túi thẩm tách 3.000-5.000 Da, mỗi túi có 2 mL hỗn hợp. Trong 12 giờ đầu, 6 giờ thẩm tách sản phẩm 1 giờ 1 lần với 18 mL nước. (1 giờ lấy 18 mL nước ra rồi cho vào 18 mL nước mới). Thẩm tách tương tự trong 12 giờ tiếp. Trích giữ nước thẩm tách để đo hàm lượng thuốc chưa mang.
Khảo sát quá trình giải phóng thuốc DOX
Mẫu nano silica biến tính đã mang thuốc được sử dụng để khảo sát q trình giải phóng trong 2 môi trường dung dịch đệm phosphat (PBS) và đệm acetat. Cách thực hiện như sau:
Mỗi túi thẩm tách chứa 2 mL hệ nano silica mang thuốc trên, tiến hành thẩm tách với 18 mL dung dịch đệm PBS (pH 7,4) và Acetat (pH 4,5). Lấy mẫu trong thời gian 4 ngày theo thời gian 1giờ, 2 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 84 giờ và 96 giờ. Nồng độ DOX được giải phóng ra mơi trường được xác định bằng phương pháp UV-Vis.
Để đảm bảo kết quả tính được chính xác mẫu đo được lấy giá trị trung bình.
Hình 2.16. Sơ đồ quy trình mang DOX
2.2.3. Thử nghiệm độc tính tế bào
Qui trình xác định hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện tại phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ mơn Di truyền, Khoa Sinh học Phân tử, Đại học Khoa học Tự nhiên.
2.2.4.1. Phương pháp ni cấy tế bào
Dịng tế bào ung thư vú (MCF-7), ung thư phổi (NCI H460), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư gan (Hep G2) và ung thư máu (Jurkat) do ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy trong môi trường E’MEM (MCF-7, NCI H460, HeLa và Hep G2) hoặc RPMI (Jurkat) có bổ sung L-glutamine (2 mM), HEPES (20 mM), amphotericin B (0,025 μg/mL), penicillin G (100 UI/mL), streptomycin (100 μg/mL), 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò FBS và ủ ở 37oC, 5% CO2.
2.2.4.2. Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB
Tế bào đơn được cấy trên những đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ là 104 tế bào/giếng (đối với dòng tế bào HeLa, Hep G2 và MCF-7); 7,5.103 tế bào/giếng (đối với dòng NCIH460) và 5.104 tế bào/giếng đối với dịng tế bào Jurkat. Sau 24 giờ ni cấy, quần thể tế bào được ủ với chất khảo sát ở các nồng độ trong 48 giờ. Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm được cố định bằng dung dịch Trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh (riêng Jurkat là 70%) và nhuộm với dung dịch Sulforhodamine B 0,2% (Sigma). Kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở hai bước sóng 492 nm và 620 nm. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Xử lý kết quả:
Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm và 620 nm (ký hiệu là OD492 và OD620):
- Tính giá trị OD = OD492 – OD620 (1)
- Tính OD492 (hoặc OD620) = ODtb – ODblank (2) - Tính tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức: Với: %I = (I - ODTN / ODC ) x 100%
- ODtb : giá trị OD của giếng có chứa tế bào
- ODblank : giá trị OD của giếng (khơng có chứa tế bào) - ODTN : giá trị OD của mẫu thử tính từ cơng thức (1) và (2)
- ODC : giá trị OD của mẫu chứng (control) tính từ cơng thức (1) và (2)
IC50 được xác định bằng cách sử dụng phần mềm Prism với phương pháp hồi qui khơng tuyến tính đa thơng số và R2 > 0,9.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN3.1. Đặc trưng của vật liệunano silica xốp (PNS) 3.1. Đặc trưng của vật liệunano silica xốp (PNS)
3.1.1. Khảo sát kích thước hạt PNS bằng phương pháp solgel
Kích thước hạt đóng vai trị quan trọng đối hệ dẫn truyền thuốc. Sau khi được tiêm vào tĩnh mạch, các hạt chất mang kích thước nhỏ (10 – 20 nm) hầu hết bị bài tiết thông qua thận, trong khi các hạt lớn hơn (≥ 200 nm) bị thu hút bởi hệ thống lưới nội mơ (RES). Chỉ có các hạt nano có kích thước dao động trong khoảng 20 – 100 nm là có khả năng đi qua các mao quản cực nhỏ và không bị thu hút hoặc chọn lọc bởi hệ thống lưới nội mô, kết quả là thời gian tồn tại của hệ mang thuốc trong hệ thống tuần hoàn được kéo dài và hiệu quả của thuốc hướng đích được nâng cao [59].
Theo Bogush và các cộng sự [60, 61], năm thông số quan trọng ảnh hưởng đến sự phân bố kích thước hạt là: (i) hàm lượng tetraethyl orthosilicate (TEOs), (ii) ethanol, (iii) ammoniac, (iv) nước và (v) nhiệt độ.
Để tạo ra những hạt nano silica xốp có kích thước mong muốn phù hợp với mục tiêu mang thuốc, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng TEOs, ammoniac và ethanol. Cetyltrimethylamonium bromide (CTAB) là chất hoạt động bề mặt dùng để tạo hình lỗ xốp được giữ cố định là 2,6 (g) trong tất cả các thí nghiệm.
(i) Hàm lượng TEOs:
Theo Stober và cộng sự [62] cho rằng khơng có sự ảnh hưởng của TEOs lên kích thước hạt.
Bogush và cơng sự [63] cho thấy kích thước hạt tăng khi tăng lượng TEOs.
Helden và cộng sự [64] chứng minh ngược lại, khi tăng lượng TEOs thì kích thước giảm.
Để làm sáng tỏ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành khảo sát lượng TEOs, các chất còn lại ammoniac và ethanol giữ nguyên lượng không thay đổi. Kết quả là khi tăng lượng TEOs từ 6 đến 10 mL thì kích thước giảm từ 92,8 nm đến 56,6 nm. Nhưng khi tiếp tục tăng lượng TEOs từ 10 đến 14 mL thì kích thước hạt lại tăng từ 56,6 đến 153,8 nm (xem phụ lục 1 và hình 3.1)).
Giải thích:
TEOs thủy phân ngưng tụ trong môi trường nước sẽ tạo thành những hạt nano silica hình cầu bao quanh CTAB. Khi tăng lượng TEOs nhưng lượng CTAB cố định thì CTAB sẽ
chia đều ra để phù hợp với lượng TEOs làm cho hạt nhỏ đi vì lõi ít thì hạt sẽ nhỏ. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng TEOs thì hạt nano mới hình thành bao quanh hạt nano trước làm cho kích thước tăng lên.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của TEOs lên kích thước hạt
(i) Thể tích ethanol
Theo nghiên cứu của Kota Sreenivasa Rao và cộng sự [19], khi giảm nồng độ ethanol từ 8(M) xuống 4(M) thì kích thước hạt nano giảm đáng kể. Tiếp tục kế thừa nghiên cứu trên, chúng tôi khảo sát thể tích của ethanol tại NH3 2,8% và TEOs 2,8 mL. Kết quả cho thấy khi ethanol tăng kích thước hạt tăng theo, thể tích ethanol ở 5,8 mL cho kích thước hạt nhỏ nhất (xem phụ lục 1 và hình 3.2).
Hình 3.2. Ảnh hưởng của ethanole lên kích thước hạt
Phản ứng thủy phân xảy ra rất chậm, việc sử dụng ammoniac làm xúc tác cho phản ứng thủy phân và ngưng tụ TEOs trong ethanol. Theo Matsoukas và Gulari [65], kích thước tăng đạt được bởi việc tăng nồng độ ammoniac và nước. (xem phụ lục 1 và hình 3.3).
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ amoniac lên kích thước hạt
Từ kết quả khảo sát trên, để đạt được kích thước mong muốn từ 20-100 nm thì chúng tơi tiến hành phản ứng này ở 60oC, hỗn hợp gồm 64 mL nước cất và 2,6 g cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB); 11,25 mL ethanol và 550 µL NH3 (2,8%), 8 mL tetraethyl orthosilicate (TEOS) khuấy với tốc độ vòng là 300 vòng/phút.
3.1.2. Ảnh TEM của vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol-gel
Qua kết quả đo TEM, PNS được tổng hợp ra hồn tồn có kích thước nano dao động trong khoảng 50 nm đến 60 nm. So sánh với nghiên cứu, ta thấy các hạt nano silica hình cầu có độ đồng đều cao, với cấu trúc như thế ta có thể kết luận rằng đã tổng hợp thành công nano silica kiểm sốt được hình dạng hạt. Giải quyết được vấn đề vơ định hình và kiểm sốt kích thước cũng như hình dạng là một trong những khó khăn để đưa loại vật liệu này vào thực tế. Với kích thước đã đạt 58,93±2,42; PNS (nano silca xốp) tổng hợp từ TEOS bằng sol-gel phù hợp với khoảng kích thước của hệ nano dẫn truyền thuốc (20÷100 nm) [59].
Hình 3.4. Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của nanosilica xốp (PNS)
3.1.3. Kết quả phân tích ảnh SEM của vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp kết tủa.
Quá trình tổng hợp nano silica từ vỏ trấu bằng phương pháp kết tủa khi cho từ từ HCl vào dung dịch sodium silicate (Na2SiO3). Thực hiện với nhiều thí nghiệm thay đổi nồng độ HCl từ 1,5 N;1,0 N và 0,5 N nhận thấy kích thước hạt giảm dần theo thứ tự 30-60 nm; 25-35 nm và 10-15 nm. Đó là do với lượng sodium silicate (Na2SiO3) cố định, khi nồng độ HCl càng giảm, lượng acid dùng cho kết tủa ít lại làm cho phản ứng xảy ra chậm hơn, và hạt càng nhỏ hơn Hình 3.5.
Hình 3.5. Ảnh SEM của nano silica xốp (PNS) tổng hợp từ vỏ trấu bằng phương pháp kết tủa theo nồng độ HCl 1,5 N;1,0 N và 0,5 N
So sánh ảnh SEM nano silica xốp (PNS) tổng hợp từ vỏ trấu với các nghiên cứu đã thực hiện thì thấy hạt tổng hợp được có hình cầu rõ rệt, kích thước tương đối đồng đều [55, 66, 67].
Tuy nhiên, nano silica xốp tạo được từ phương pháp sol-gel có hình dạng trịn đều và đẹp hơn nano silica xốp tạo từ phương pháp kết tủa. Do đó, chọn nano silica xốp làm từ sol- gel cho các q trình biến tính và mang thuốc của luận án.
3.1.4. Kết quả phân tích giản đồ XRD của vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợpbằng phương pháp sol-gel và phương pháp kết tủa bằng phương pháp sol-gel và phương pháp kết tủa
Như chúng ta đã biết phổ nhiễu xạ tia X cung cấp nhiều thơng tin quan trọng về hình dạng cũng như cấu trúc vật liệu. Để xác nhận hạt nano có cấu trúc xốp ta lần lượt tiến hành phân tích phổ XRD góc rộng với góc qt từ 10o đến 80o đối với 2 mẫu vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol-gel và phương pháp kết tủa.
Điều kiện ghi mẫu ống phát tia CuK với = 1.54056 Å, điện thế 40kV, mẫu bột, tốc độ 0.005o/giây.
Ở hình (3.6 a) là nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol-gel, ta thấy tín hiệu đặc trưng của silica ở 2θ = 22o, đỉnh vẫn rất nhọn cho thấy khơng có sự sụp cấu trúc tinh thể của hạt. Vậy hình dạng phổ cho thấy hạt đã có cấu trúc riêng biệt khơng cịn là dạng vơ định hình [68, 69].
Ở hình (3.6 b) là mẫu vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp kết tủa, so sánh với phổ nhiễu xạ góc rộng XRD của nano silica xốp tổng hợp bằng phương pháp sol-gel cho thấy có sự tương đồng. Và so sánh với các nghiên cứu khác cũng vậy. Qua đó đã hồn thành tổng hợp được vật liệu nano silica xốp theo cả 2 phương pháp sol-gel và kết tủa [67, 70].
Như vậy ta đã tạo được hạt nano silica với cấu trúc xốp, việc tạo ra lỗ xốp có vai trị rất quan trọng đối với khả năng mang thuốc của vật liệu [71].
Hình 3.6. So sánh giản đồ XRD của nano silica xốp tổng hợp bằng phương pháp kết tủa (a) và bằng phương pháp sol-gel (b).
3.1.5. Kết quả FT-IR của vật liệu nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol-gel và phương pháp kết tủa gel và phương pháp kết tủa
Để xác định các nhóm chức của vật liệu ta tiến hành phân tích phổ FTIR và ta thấy các dao động ở các số sóng như sau:
FTIR của PNS tổng hợp từ phương pháp Sol-Gel[ 72 , 73 ]:
- Dao động kéo dãn và uốn cong lần lượt hấp thu ở số sóng 3417 cm-1 và 1615 cm-1
- Ba đỉnh hấp thu đặc trưng cho là 1093 cm-1, 813 cm-1 và 466 cm-1 đặc trưng cho giao động kéo giãn của Si-O-Si.
- Đỉnh hấp thu tại số sóng 813 cm-1đặc trưng cho dao động liên kết của Si-OH (nhóm silanol).
FTIR của PNS tổng hợp từ phương pháp kết tủa
- Dãy hấp thu rộng thể hiện dao động kéo dãn ở các bước sóng 3436 cm-1 và 1627 cm-1 thuộc về nhóm –OH (silanol, Si-OH) [71, 74].
- Siloxane hấp thu mạnh trong miền 1130 cm-1 – 1000 cm-1 cụ thể là 1067 cm-1. Và đỉnh hấp thu có bước sóng ở 797 cm-1 là Si-O-Si.
Vậy qua kết quả phân tích FTIR và so sánh với các nghiên cứu [75, 76]thì bước đầu chúng tơi đã tổng hợp thành công được vật liệu nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp sol-gel và phương pháp kết tủa
Hình 3.7. So sánh phổ FT-IR của nano silica xốp (PNS) tổng hợp bằng phương pháp sol- gel và bằng phương pháp kết tủa