CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2. Biến tính nanosilica xốp
3.2.2. Biến tính thơng qua cầu nối APTES
Mặc dù (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) được gắn lên PNS trở thành PNS- APTES dùng làm cầu nối trong q trình biến tính PNS. Tuy nhiên, có một điều thú vị là PNS-APTES có nhóm amino (-NH2) nên cũng có khả năng mang DOX thơng qua liên kết amine. Do đó, chúng tơi dùng PNS-APTES làm chất mang thuốc số 3 và khảo sát khả năng mang giải phóng.
3.2.2.1. Biến tính bằng gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-gelatin cịn gọi PNS-APTES- COOH-GE (chất mang thuốc 4))
Phân tích kết quả phổ FTIR
Để chứng minh cho sự thành cơng khi biến tính từng bước các nhóm chức lên bề mặt PNS. Ta tiến hành đo từng mẫu trong cùng điều kiện và nhận thấy rằng:
Mũi hấp thu ở 1615 cm-1 là dao động uốn của OH của phân tử nước bị hấp phụ trong vật liệu.
Băng hấp phụ 3417 cm-1 tượng trưng cho dao động uốn cong của O-H trên bề mặt PNS. Đỉnh hấp thu tại 1093 cm-1 và 813 cm-1 mô tả dao động kéo giãn của Si-O-Si và Si-O. Đỉnh hấp thu tại 2417 cm-1 tương ứng với dao động kéo giãn của nhóm C-H.
Xem phổ (b); nhóm amino được thể hiện qua dao động đối xứng tại 1435 cm-1 và 860 cm-1
chứng minh APTES đã gắn lên bề mặt PNS.
Qua phổ (c) cho thấy khi PNS-APTES tạo liên kết hóa học với anhydrid succinic hình thành nên PNS-APTES-COOH hấp thu đặc trưng tại 1630 và 1560 cm-1
Phổ (d) cho thấy đỉnh hấp thu tại 1610 và 1541 cm-1 tương ứng với nhóm amino trong Gelatin [80].
Hình 3.13. FTIR của (a) PNS, (b) PNS-APTES, (c) PNS-APTES-COOH, (d) PNS- APTES- COOH-GE
Kết quả trên đã được so sánh đối chiếu với nghiên cứu của J. Zhang và cộng sự [81] thấy có sự tương đồng chứng minh gelatin đã biến tính thành cơng trên bề mặt PNS.
Kích thước hạt nano silicate biến tính bằng chụp TEM
Hình 3.14. Ảnh TEM của vật liệu nano silicate sau khi biến tính bằng gelatin
Qua hình ảnh TEM và phân bố kích thước của PNS-APTES-COOH-GE cho thấy hạt PNS sau biến tính bằng gelatin có dạng hình cầu, kích thước đồng đều trong khoảng 60- 70nm, với kích thước đó hạt có khả năng kéo dài thời gian lưu thông trong máu tránh sự hấp thu có chọn lọc ở gan, nhưng đủ nhỏ để tránh lọc cơ học bởi lá lách. Ngồi ra, kích thước trong khoảng (50 – 100nm) cho phép các hạt nano nhắm mục tiêu thụ động vào các tế bào
khối u thơng qua hiệu ứng tăng tính thấm và duy trì (EPR), tăng cường tích lũy nội bào và định vị các hạt nano trong khu vực khối u [82].
3.2.2.2. Biến tính PNS bằng GEL-mPEG (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG hay cịn gọi tắt là PNS-Gelatin-mPEG (chất mang thuốc 5) còn gọi tắt là PNS-Gelatin-mPEG (chất mang thuốc 5)
Kích thước hạt nano silicate biến tính bằng chụp TEM
Từ TEM ta nhận thấy hệ sau khi biến tính vẫn ở dạng hạt hình cầu. So sánh với kích thước hạt PNS thì kích thước hạt PNS-Gelatin-mPEG tăng lên sau biến tính và đạt độ đồng đều tương đối cao. Kích thước PNS sau khi biến tính là 69,60±3,27 nm.
Hình 3.15. Ảnh TEM, sơ đồ phân bố kích thước hạt của vật liệu nano silicate trước biến tính(a,b) và sau biến tính bằng GEL-mPEG (c,d)
Phân tích nhiễu xạ tia X
Để tiến hành kiểm tra sự thay đổi về cấu trúc tinh thể của hạt nano silica sau khi biến tính bằng Gelatin-mPEG, nghiên cứu tiến hành phân tích nhiễu xạ tia X và thu được kết quả sau:
Hình 3.19 (a) có hai đỉnh nhiễu xạ cực đại xung quanh 3,4o và 6,8o đặc trưng cho lõi CTAB (Cetyltrimethylamnonium bromide). Sản phẩm được đo khi còn nguyên CTAB chưa ngâm hỗn hợp nano silica trong dung dịch acid acetic để rút lõi.
Hình 3.19 (b) có hai đỉnh nhiễu xạ cực đại trong khoảng 20o và 26o tương ứng với sự hiện diện của nano silica.
Hình 3.19 (c), giản đồ XRD của mẫu PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG cho thấy sự tăng cường độ nhiễu xạ ở 26,9o và phản xạ mới xuất hiện ở 2θ là 23,2o; phản xạ yếu ở 26,9 o là do
liên hợp với GEL-mPEG góp phần chứng minh cho sự thành công của PNS-APTES- COOH-GEL-mPEG.
Hình 3.16. Giản đồ XRD góc nhỏ của (a) PNS (CTAB), (b) PNS-COOH, and (c) PNS-GEL- mPEG.
Giản đồ nhiễu xạ tia X của hạt nano PNS-Gelatin-mPEG tổng hợp được cho thấy sự xuất hiện của các mũi đặc trưng của nano silica 2θ = 22là phù hợp với cấu trúc xốp của hạt nano silica[83]. Trên giản đồ cũng xuất hiện mũi đặt trưng của PEG và gelatin.Kết quả thu được từ mẫu PNS-Gelatin-mPEG giống với mẫu của PNS. Điều đó cho thấy rằng sau khi được biến tính bởi Gelatin-mPEG, khơng ảnh hưởng tới cấu trúc hạt nano silica.
Phân tích kết quả phổ FTIR
Quan sát phổ IR, nhận thấy có cả các dao động của phổ PNS-COOH và phổ Gelatin- mPEG ở các bước sóng như sau:
- N-H dao động kéo giãn và N-H uốn cong lần lượt hấp thu ở bước sóng 3424 cm-1 và 1564 cm-1.
- C-H dao động kéo giãn đối xứng của PEG hấp thu ở bước sóng 2888 cm-1.
- Các đỉnh của Gelatin hấp thụ ở bước sóng: 2741 cm-1; 2696 cm-1; 842 cm-1; 1107 cm-
1;
- Các đỉnh nằm trong peak lớn đặc trưng của nano silica. Các peak hấp thu có bước sóng ở 462 cm-1, 530 cm-1, 1.061 cm-1 là của Si-O-Si. C-Si-O hấp thu ở bước sóng 961 cm-1.
- Hai đỉnh liên kết của amide, đây cũng là đỉnh hấp thu thể hiện phản ứng biến tính hệ nano thành cơng. Liên kết C=O dao động kéo dãn hấp thu ở bước sóng 1659 cm-1 và liên kết N-H giao động uốn cong hấp thu ở bước sóng 1564 cm-1.
Từ kết quả trên, chứng tỏ các dao động đặt trưng của các giai đoạn tổng hợp vẫn còn và cả những dao động liên kết của C=O và N-H. Như vậy, phổ này góp phần minh chứng đã tổng hợp và biến tính thành cơng hệ nano silica.
Hình 3.17. Phổ FTIR của (a) PNS, (b) PNS-APTES (c) PNS-APTES-COOH, (d) GEL- mPEG, and (e) PNS-GEL-mPEG
Phân tích bằng giản đồ TGA của hệ PNS-APTES-Gelatin-mPEG
Để khẳng định thêm việc biến tính Gelatin-mPEG trên vật liệu nano silica xốp, chúng tơi tiến hành phân tích TGA. Mẫu được nung trong khí quyển đến 800oC, gia nhiệt 10oC/phút. Qua kết quả phân tích giản đồ TGA ta nhận thấy:
- Giai đoạn đầu dưới 200 oC, trên giản đồ nhiệt của PNS giảm nhẹ khoảng 20% trọng lượng đó là sự bay hơi nước trên bề mặt nano silica và sự ngưng tụ của silanol [84] - Xét giản đồ TGA của PNS-COOH cho thấy mức tăng khối lượng cao hơn PNS
khoảng 89% đó là sự phân hủy nhiệt của nhóm anhydride succinic chứng minh PNS- COOH đã được tổng hợp.
- So sánh giản đồ phân tích nhiệt của PNS-GEL-mPEG và GEL-mPEG, từ nhiệt độ 300 oC đến 600 oC ta thấy trên giản đồ của PNS-GEL-mPEG có một lượng giảm đi
đáng kể 85,30%, đó chính là khối lượng đại diện cho GEL-mPEG trên bề mặt đã biến tính trên nano silica xốp (PNS).
Hình 3.18. Giản đồ TGA của PNS; PNS-APTES-COOH; GEL-mPEG và PNS- GEL-mPEG Đường đẳng nhiệt hấp phụ BET (Brunauer-Emmett-Teller)của hệ PNS-APTES-COOH-
GEL-mPEG
Đo BETcủa hệ PNS-APTES-GEL-mPEG để khảo sát diện tích bề mặt cũng như dự đốn được cấu trúc vật liệu. Từ đường hấp phụ đẳng nhiệt trên ta thấy vật liệu sau biến tính vẫn có cấp trúc xốp. Hệ nano silica xốp (PNS) sau khi biến tính bằng GEL-mPEG có diện tích bề mặt là 7,7245 m²/g, diện tích bề mặt này khá nhỏ hơn rất nhiều so với hệ chưa biến tính đó là do gelatin có cấu trúc polymer che chắn phần lớn bề mặt PNS. Tuy nhiên với sự biến tính gelatin sẽ góp phần tạo thêm nhiều nhóm amino (-NH2) và nhóm carbonyl (C=O) trên bề mặt vật liệu nhằm mong muốn tạo liên kết imine giữa vật liệu và thuốc, hứa hẹn một hiệu suất mang thuốc cao và kết quả giải phóng DOX tốt hơn hệ chưa biến tính [22].
3.2.2.3. Biến tính SS-CS-PEG (tổng hợp PNS@CS-PEG hay cịn gọi là PNS-APTES-SS- COOH-CS-PEG (chất mang thuốc 6))
Kích thước hạt nano silicate biến tính bằng CS-PEG (PNS-APTES-SS-COOH-CS-mPEG) qua ảnh chụp TEM
Kích thước và hình dạng của hạt nano là yếu tố quan trọng trong việc ứng dụng làm chất dẫn truyền thuốc. Qua ảnh TEM cho thấy, các hạt nano PNS@CS-PEG có dạng hình cầu, phân bố đều, kích thước trung bình là 65±15 nm, phù hợp để mang thuốc.
Hình 3.20. Ảnh TEM của vật liệu PNS@CS-PEG và sơ đồ phân bố kích thước hạt Phân tích kết quả phổ FTIR hạt Phân tích kết quả phổ FTIR
Quan sát phổ FT-IR, nhận thấy ở các bước sóng như sau:
- 1100 cm-1 và 900 cm-1 mơ tả dao động kéo giãn bất đối của liên kết Si-O-Si và sự kéo dài liên kết C-O
- Đỉnh hấp thu 1600 cm-1 đặc trưng nhóm OH
- Sự hấp thu của nhóm carboxyl (C=O), dao động kéo giãn của amin bậc 1, và dao động uốn cong N-H của amin bậc 2 lần lượt là 1690 cm-1, 1639 cm-1 và 1568 cm-1. - Dải hấp thu 3400 cm-1 mô tả O-H của nhóm C-OH có trong PEG
- Dải hấp thu 2880 cm-1 tương ứng với giao động kéo dãn –CH2 trong mạch alkyl - Bước sóng ở 1050 cm-1 tương ứng với giao động C-O-C của nhóm PEG
Hình 3.21. FT-IR của (a) PNS và (b) PNS@CS-PEG
3.2.3. Nhận xét chung các hệ biến tính
Dựa trên kết quả chụp ảnh thơng qua kính hiển vi điện tử truyền suốt (TEM) ta thấy kích thước của các hệ biến tính tăng dần PNS (58,93±2,42 nm); PNS-GPTMS-CS-mPEG (62,89±2,93 nm); PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG (69,60±3,27 nm) đó là do cấu trúc các polymer sinh học chitosan và gelatin khá lớn làm cho kích thước tăng. Và do bởi có cấu trúc polymer phức tạp nên PNS sau biến tính đã bị che chắn phần lớn bề mặt dẫn đến diện tích bề mặt (BET) của PNS vốn đã thấp nay bị các polymer sinh học che nên giảm đáng kể PNS
(129,818 m2/g); PNS-GPTMS-CS-mPEG (91,380 m2/g); PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG
(7,245 m2/g).
Bảng 3.1. Số liệu tương quan giữa diện tích bề mặt (BET) và kích thước hạt (TEM) của hệ PNS trước và sau biến tính
Chất mang thuốc Diện tích bề mặt (m2 /g) Kích thước hạt (nm)
PNS 129,818 58,93±2,42
PNS-GPTMS-CS-mPEG 91,380 62,89±2,93
Hình 3.22. Đồ thị tương quan giữa diện tích bề mặt (BET) và kích thước hạt (TEM) của
hệ PNS trước và sau biến tính.
Dù các hệ PNS sau biến tính giảm giá trị BET nhưng khơng bị ảnh hưởng đến hiệu suất mang thuốc vì hệ biến trên cơ sở sẽ tạo liên kết hóa học và tăng tính hấp phụ thuốc từ đó sẽ cho hiệu suất mang thuốc và khả năng giải phóng thuốc tốt hơn. Vấn đề này sẽ được làm sáng tỏ trong phần trình bày khảo sát mang và giải phóng thuốc trong các nghiên cứu tiếp theo sau đây.
3.3. Kết quả mang và giải phóng thuốc
3.3.1. Kết quả mang và giải phóng thuốc của PNS
3.3.1.1. Xây dựng đường chuẩn 5-Fluorouracil (5-FU)
5-FU hòa tan trong nước khử ion trở thành dung dịch không màu hơi đục cho nên kết quả mang và giải phóng thuốc được xác định thơng qua phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Trước khi tiến hành xác lượng thuốc 5-FU trong chất mang ta tiến hành xây dựng đường chuẩn 5-FU.
Đường chuẩn của 5-FU được dựng bằng cách đo HPLC các dung dịch đã pha sẵn nồng độ lần lượt là 20 ppm, 40 ppm, 60 ppm, 80 ppm, 100 ppm. Bằng cách này ta sẽ được đồ thị hàm số dạng y = ax + b, trong đó y chính là diện tích đỉnh (peak) cịn x chính là nồng độ.
Bảng 3.2. Số liệu đường chuẩn thuốc 5FU
Nồng độ 5-FU (ppm) Area (mAU*s)
0 0 20 652,8 40 1306,8 60 1942,6 80 2561,8 100 3211,8
Hình 3.23. Đường chuẩn 5-FU
Sau khi khảo sát khả năng mang cũng như giải phóng của vật liệu, đo HPLC ta sẽ biết được diện tích peak, gắn vào phương trình đường chuẩn có sẵn chúng ta sẽ biết được nồng độ thuốc.
3.3.1.2. Xây dựng đường chuẩndoxorubicin (DOX)
Thuốc doxorubicine khi hòa tan trong nước khử ion có màu cam đặc trưng nên có thể xác định lượng thuốc mang và giải phóng thông qua phương pháp đo UV-Vis.
Đầu tiên, tiến hành dựng phương trình đường chuẩn DOX bằng cách đo UV-VIS các dung dịch đã pha sẵn nồng độ lần lượt là 1,25 ppm; 2,50 ppm; 5,00 ppm; 10,00 ppm; 20,00 ppm; 40,00 ppm; 60,00 ppm. Các mẫu được đo tại bước sóng 485 nm.
Bảng 3.3. Số liệu đường chuẩn thuốc DOXNo. 1 2 3 4 5 6 7 No. 1 2 3 4 5 6 7 C (mg/l) (Nồng độ) 1,25 2,50 5,00 10,00 20,00 40,00 60,00 Abs. (Độ hấp thu) 0,056 0,091 0,171 0,327 0,645 1,280 1,882
Hình 3.24. Đường chuẩn thuốc DOX3.3.1.3. Khảo sát tỉ lệ giữa thuốc DOX và chất mang 3.3.1.3. Khảo sát tỉ lệ giữa thuốc DOX và chất mang
Trước khi tiến hành mang thuốc, cần khảo sát tỉ lệ giữa thuốc DOX và chất mang từ đó sử dụng một tỷ lệ phù hợp cho tất cả những hệ mang thuốc [35].
Bảng 3.4. Số liệu khảo sát tỉ lệ giữa thuốc DOX và chất mang
Thí nghiệm Lượng chất mang (mg) Lượng thuốc DOX (mg) Hiệu suất mang thuốc (%)
1 10 1,0 20,96± 0.15
2 10 1,5 21,79± 0.04
3 10 2,0 22,93± 0.13
4 10 2,5 23,01± 0.03
Hình 3.25. Tỉ lệ giữa thuốc và chất mang
Qua kết quả khảo sát cho thấy tỉ lệ phù hợp giữa thuốc và chất mang là (1:4) nên chọn tỷ lệ mang thuốc này cho tất cả các hệ biến tính.
3.3.1.4. Kết quả mang thuốc 5-FU của PNS (nano silica xốp)
Sau khi thuốc được mang, đem hỗn hợp thuốc và chất mang cho vào màng thẩm tách, ngâm trong thuốc khử ion để loại thuốc tự do, đo HPLC lượng thuốc tự do được kết quả như sau:
Lượng thuốc tự do (mg): 12,66 (mg)
Lượng thuốc chứa trong mẫu (mg) = lượng thuốc ban đầu – thuốc tự do = 15-12,66 = 2,34 (mg)
Từ dữ liệu tính được hiệu suất mang thuốc và khả năng chứa thuốc 5-FU của hạt nano silica xốp (PNS) theo công thức:
Hiệu suất mang thuốc (DLE)
Lượng thuốc chứa trong mẫu 2,34
DLE (%)
= Tổng lượng thuốc ban đầu
x 100% =
15,00 x 100% = 15,60 ± 1,85 %
Khả năng chứa thuốc của chất mang (DLC)
Lượng thuốc chứa trong mẫu DLC (%) =
Tổng lượng chất mang và lượng thuốc
trong mẫ
2,34
x 100% =
u
3,75 ± 0,12%
Khả năng chứa thuốc 5-FU của chất mang PNS (DLC):3,75 ± 0,12%.
Từ kết quả tính tốn số liệu DLE và DLC, ta thấy rằng hạt nano silica có hiệu suất mang thuốc là 15,60 ± 1,85% và khả năng chứa thuốc là 3,75 ± 0,12%. So với các nghiên cứu đã thực hiện thì kết quả vẫn chưa cao [85], do đó chúng tơi biến tính chất mang nano silica xốp (PNS) với mong muốn nâng cao hiệu suất mang thuốc.
3.3.1.5. Kết quả giải phóng thuốc 5-FU của PNS (nano silica xốp)
Thuốc sau khi mang được khảo sát giải phóng trong thời gian 1giờ, 2 giờ, 3 giờ đến 48 giờ với 2 môi trường dung dịch đệm acetat (pH 4,5) và phosphat (PBS)(pH 7,4). Kết quả HPLC cho thấy lượng thuốc giải phóng ra bằng 0 (mg) trong mọi thời điểm (xem hình 3.28 a và b).
Hình 3.26. Phổ HPLC của 5-FU (a) và HPLC của hệ PNS chứa 5-FU giải phóng (b)
Nhận xét và giải thích
Với cách mang thuốc thơng thường là hịa tan thuốc và chất mang vào nước khử ion, trộn lẫn 2 hỗn hợp trên, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Cách mang này chỉ hiệu quả với DOX nhưng khơng hiệu quả với 5-FU vì DOX tạo liên kết hóa học với chất mang cịn 5-FU thì khơng.
Để mang được thuốc 5-FU vào vật liệu, cho chất mang vào một ống nhỏ giọt, đổ dung dịch thuốc hòa tan trong nước khử ion và cho chảy qua ống giống như hình thức của sắc ký cột. Với cách đó, 5-FU được mang vào hạt nhưng giữ chặt ln trong hạt nano silica xốp (PNS) và khơng giải phóng được thuốc.
3.3.1.6. Kết quả mang thuốc DOX của PNS (nano silica xốp)
Bằng cách xác định lượng thuốc chưa mang được, ta có thể dễ dàng phân tích được hiệu suất mang thuốc và khả năng mang thuốc của hệ PNS.
Từ kết quả tính tốn số liệu DLE và DLC, ta thấy rằng hạt nano silica có hiệu suất mang thuốc (DLE) là 23,01 ± 2,16% và khả năng chứa thuốc (DLC) là 2,09 ± 0,32%. So với các nghiên cứu đã thực hiện thì kết quả vẫn chưa cao [58, 86], đó là do các hạt nano silica mang