Trong phản ứng thủy phân, các nhóm alkoxide (–OR) trong liên kết kim loại – alkoxide được thay thế bằng nhóm hydroxyl (–OH) của môi trường để tạo thành liên kết kim loại – hydroxyl. Trong khi đó, phản ứng ngưng tụ tạo nên liên kết kim loại – oxide – kim loại, đây là cơ sở cấu trúc cho các màng oxide kim loại. Hiện tượng ngưng tụ diễn ra liên tục làm cho liên kết kim loại–oxi–kim loại không ngừng tăng lên đến khi tạo ra một mạng lưới trong khắp dung dịch.
Sử dụng chất hoạt động bề mặt Cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) như một tác nhân định hình cấu trúc lỗ xốp cho vật liệu nano, đây cũng có thể xem là khung sườn để TEOS có thể thủy phân và bao lấy tạo điều kiện cho việc hình thành các hạt nano silica xốp sau này, các hạt nano silica xốp được tạo ra với mong muốn có thể mang thuốc được nhiều hơn nhờ vào cấu trúc lỗ xốp của vật liệu [51].
1.6.1.2. Tạo cầu nối biến tính
Như đã trình bày, việc biến tính bề mặt vật liệu nano silica nhằm tăng hoạt tính sinh học, nâng cao hiệu quả mang thuốc, kéo dài thời gian lưu thơng thuốc và giải phóng tại đúng mục tiêu.
Để thuận lợi cho việc biến tính, chúng ta thường tạo cầu nối trước khi biến tính. Chất làm cầu nối thường có một đầu tạo liên kết hóa học với nhóm OH trên bề mặt nano silicas và đầu còn lại thường mang nhóm có hoạt tính mạnh dễ dàng tạo phản ứng với các chất biến tính. Trong đề tài chúng tơi chọn (3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) và (3- aminopropyl)triethoxysilane (APTES) làm cầu nối.
Tổng hợp PNS-GPTMS
Hình 1.14. Cấu trúc (3-glycidoxypropyl)trimethoxysilane
Nhóm epoxide hoạt động hóa học rất tốt và nó có khả năng tham gia nhiều phản ứng. Bởi vì glycidyl ether có chứa nhóm epoxide nên nó được ứng dung rất nhiều trong hóa sinh. Khi tồn tại ion H+, vịng epoxide sẽ bị ion hóa, hoạt tính mạnh sẽ tham gia phản ứng với các tác nhân thân hạch (ái nhân). Vòng epoxide bị bẻ gãy và kết quả là hình thành nhóm alcol.
Với các acid hữu cơ, các alcol được hình thành sau đó là phản ứng ester hóa diễn ra. Các phenol phản ứng để tạo ra nhóm alcol và vịng thơm được gắn vào thơng qua liên kết ether.
Một vài chất ái nhân (thân hạch) có thể phản ứng trên epoxide, kết quả là vòng này bị bẻ gãy và nguyên tử oxy trở nên rất thân hạch.
Vòng epoxide còn được biết như là một trong những tác nhân alkyl hóa hoặc là tác nhân thân điện tử, bởi việc hình thành ion carbonium, ion này có thể phản ứng với các tác nhân thân hạch (ái nhân).
Hình 1.15. Phản ứng tạo cầu nối GPTMS trên nano silica xốp (PNS-GPTMS).
Giai đoạn này có thể xem là giai đoạn hoạt hóa hạt silica, bởi ngồi những thuận lợi của cầu nối epoxy thì GPTMS khơng gây độc cho cơ thể và phản ứng của nó lên bề mặt silica là rất êm dịu, tránh được những biến đổi bề mặt không cần thiết trên hạt silica.
Tổng hợp PNS-APTES
Các hạt nano PNS-APTES cũng được tổng hợp bằng phương pháp sol-gel, sử dụng APTES như nguồn cung cấp -NH2 cho bề mặt hạt nano silica xốp.
Ban đầu sử dụng CTAB như một tác nhân tạo khung sườn để TEOS thủy phân và ngưng tụ để tạo thành các hạt nano silica xốp, các hạt nano silica xốp được tạo ra và tiếp tục được gắn APTES với mục đích làm cầu nối cho giai đoạn biến tính với Gelatin
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp bao gồm nhiệt độ, tốc độ khuấy, xúc tác. Tuy nhiên, để đạt được kích thước mong muốn như trên thì phản ứng này nên được
tiến hành ở 60C, xúc tác NH3 với nồng độ 2,8%, cũng như tốc độ khuấy khoảng 350 vịng/phút.
Hình 1.16. Phản ứng tạo cầu nối APTES trên nano silica xốp (PNS-APTES).
1.6.2. Biến tính vật liệu nano silica xốp (PNS)
1.6.2.1. Biến tính PNS bằng Hydrazine (tổng hợp PNS-GPTMS-Hydrazine là chất mang thuốc 1)
Nhằm mục đích tạo nên nhóm hydrazine trên bề mặt nanosilica xốp và dựa trên liên kết hydrazone bền với doxorubicin tại môi trường trung tính. Chất mang sẽ mang thuốc đến đúng tế bào ung thư (có pH kém) mới giải phóng, tăng hiệu quả của phương pháp hóa trị.
Hình 1.17. Phản ứng biến tính nano silica xốp(PNS) bằng hydrazine
1.6.2.2. Biến tính PNS bằng Chitosan-mPEG (tổng hợp PNS-GPTMS-CS-mPEG là chất mang thuốc 2) mang thuốc 2)
Tổng hợp Chitosan-mPEG
Qui trình tiến hành gồm 2 bước, đầu tiên hoạt hóa mPEG bằng p-nitrophenyl carbonate (NPC) trước sau đó mới tổng hợp chitosan-mPEG
Hoạt hóa mPEG bằng p-nitrophenyl carbonate (NPC)
Phản ứng thế ái nhân (thân hạch) trên carbon của nhóm carbonyl diễn ra thuận lợi ở nhiệt độ 65C.
Hình 1.18. Phản ứng tổng hợp mPEG-p-nitrophenyl carbonate
Tổng hợp Chitosan-mPEG
Trong phản ứng này, do chitosan có cấu trúc khá lớn nên ảnh hưởng lập thể, vì vậy phải dùng dư chitosan so với dự kiến để đảm bảo sản phẩm tạo thành có nhiều liên kết amide nhất.
Phương trình phản ứng:
Hình 1.19. Phản ứng tổng hợp chitosan-mPEG Tạo liên kết giữa PNS-GPTMS và CS-mPEG mPEG Tạo liên kết giữa PNS-GPTMS và CS-mPEG
Phản ứng của chitosan lên bề mặt của nano silica vừa biến tính hồn tồn có thể tạo ra nhờ khả năng hoạt động mạnh của vòng epoxy trong pH cao lẫn pH thấp. Tuy nhiên để chọn lựa pH như thế nào để CS-mPEG vẫn còn giữ được liên kết amide của mình sau phản ứng là vấn đề đáng chú ý.
Trong nghiên cứu này, pH khoảng 3 đến 4 được lựa chọn, vì ở pH này liên kết amide này khơng bị thủy phân.
Hình 1.20. Phản ứng biến tính nano silica bởi Chitosan-mPEG.
1.6.2.3. Biến tính PNS bằng Gelatin (tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE là chất mang 4) Tổng hợp PNS-APTES- AnhydrideSuccinic 4) Tổng hợp PNS-APTES- AnhydrideSuccinic
Nhằm để biến tính hiệu quả hạt silica, luận án tiến hành gắn nhóm COOH lên bề mặt hạt nano PNS-APTES bằng cách cho PNS-APTES phản ứng với anhydride succinic trong dung mơi aceton
Hình 1.21. Phản ứng tạo gắn anhidride succinic lên PNS (PNS-APTES-COOH)
Khi cho bề mặt của hạt silica có nhóm amino phản ứng với anhydride succinic trong điều kiện lạnh và pH khoảng 6–7 và dung môi DMF. Phản ứng diễn ra theo cơ chế mở vòng anhydride succinic. Đầu tiên, đơi điện tử của nhóm amino sẽ tác kích vào nhóm carbonyl, tiếp theo là sự di chuyển proton từ nitrogen đến oxygen của vòng tạo ra liên kết của amino và hình thành nhóm -COOH bên ngồi bề mặt hạt.
Tổng hợp PNS-APTES-COOH-GE
Để q trình biến tính đạt hiệu suất cao cho quá phản ứng biến tính nano silica cần hoạt hóa nhóm -COOH của PNS-APTES-COOH trước bằng 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC):
Hình 1.22. Phản ứng hoạt hóa PNS-APTES-succinic bằng EDC.
Sau khi tiến hành hoạt hóa sẽ thực hiện q trình biến tính PNS-APTES-succinic với gelatin. Q trình tạo liên kết PNS-APTES-Succinic với gelatin theo phản ứng sau:
Hình 1.23. Phản ứng tạo liên kết PNS-APTES-Anhydride succinic với gelatin1.6.2.4. Biến tính PNS bằng Gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-GEL-mPEG hay cịn gọi là 1.6.2.4. Biến tính PNS bằng Gelatin-mPEG (tổng hợp PNS-GEL-mPEG hay cịn gọi là PNS-APTES-GEL-mPEG là chất mang 5)
Tổng hợp Gelatin-mPEG
Nhằm mục đích tăng khả năng tan trong nước cũng như tăng tính tương hợp sinh học và duy trì thời gian thuốc lưu thông trong cơ thể, nghiên cứu này tiến hành gắn mPEG cho Gelatin trước khi biến tính lên bề mặt silica. Để tổng hợp được nano Gelatin-mPEG ta tiến hành 2 bước:
Hoạt hóa mPEG bằng p-nitrophenyl carbonate (NPC)
Phản ứng thế ái nhân (thân hạch) trên carbon của nhóm carbonyl diễn ra thuận lợi ở nhiệt độ 65C như phản ứng hình 2.6.
Phản ứng xảy ra theo cơ chế tương tự như phản ứng ester hóa. Trong cấu trúc của NPC, liên kết CO có tính chất khơng no và bị phân cực mạnh về phía oxygen, làm xuất hiện mật độ điện tích dương trên nguyên tử carbon, tạo ra trung tâm thiếu điện tử.
Trong khi đó trên nguyên tử oxygen của nhóm OH của phân tử mPEG cịn hai đơi điện tử tự do, nên nguyên tử oxygen đóng vai trị như một tác nhân ái nhân (thân hạch). Trung tâm thiếu điện tử trên nguyên tử carbon của phân tử NPC gặp tác nhân ái nhân của phân tử mPEG sẽ tương tác với nhau tạo sản phẩm mPEG-NPC
Điều đáng chú ý là tác chất NPC và sản phẩm mPEG-NPC có hoạt tính rất mạnh, dễ bị thủy phân trong mơi trường nước, do đó để đạt được hiệu suất phản ứng cao thì phản ứng phải được thực hiện trong điều kiện khan nước, ở nhiệt độ thấp, trong mơi trường khí nitrogen; tác chất và dung mơi phải được làm khan trước khi tiến hành phản ứng. Để hạn chế sự thủy phân sản phẩm tạo thành, sản phẩm thu được phải được sấy khô trong tủ sấy chân khơng, bảo quản trong bình hút ẩm tránh ánh sáng và hơi ẩm trong khơng khí.
Phản ứng gắn gelatin với mPEG
Ban đầu mPEG được cho tác dụng với NPC để thu được mPEG-NPC. Tác chất này sau đó phản ứng với Gelatin để thu được sản phẩm Gelatin-mPEG.
Trong phản ứng này, do Gelatin có cấu trúc khá lớn nên ảnh hưởng lập thể, vì vậy phải pha lỗng Gelatin để đảm bảo sản phẩm tạo thành có nhiều liên kết amide nhất.
Phương trình phản ứng:
Tổng hợp PNS-APTES-Succinic-Ge-mPEG
Sau khi tiến hành hoạt hóa PNS-APTES- Anhydride succinic bằng EDC (hình 2.10), ta sẽ thực hiện phản ứng của PNS-APTES- Anhydride succinic với Gelatin-mPEG.
Hình 1.25. Phản ứng tạo liên kết PNS-APTES-Anhydride succinic với Gelatin-mPEG
Sau khi q trình tổng hợp hồn thành, sản phẩm thu được sẽ là vật liệu có kích thước nano PNS-APTES-COOH-GEL-mPEG (có thể gọi tắt là PNS-GEL-mPEG). Vật liệu này được tổng hợp với kích thước mong muốn là 20 nm < d < 100 nm, trong đó d là đường kính hạt. Ngồi ra vật liệu được tổng hợp sẽ có cấu trúc dạng tổ ong nên sẽ có nhiều lỗ xốp, nhờ vậy khi thực hiện quá trình mang thuốc các hạt thuốc sẽ có thể được hấp phụ trên bề mặt vật liệu trong các lỗ xốp.
1.6.2.5. Biến tính PNS bằng SS-CS-PEG (tổng hợp PNS-SS-CS-PEG hay cịn gọi PNS@CS- PEG là chất mang 6)
Gắn cầu nối disulfide, hình thành PNS-SS-COOH
Đầu tiên hạt nano silica xốp có kích thước thích hợp được biến tính lần lượt với tác nhân 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) để thu được PNS-APTES. Tiếp theo, PNS-APTES phản ứng với 3,3’-dithiodipropionic acid PNS-SS-COOH dưới dạng hạt nano.
Tổng hợp PNS@CS-PEG (PNS-APTES-CS-PEG)
Các bước tổng hợp được thể hiện trong như sau: Bước 1: PNS-SS-COOH được hoạt hóa với EDC
Hình 1.27. Phản ứng hoạt hóa PNS-SS-COOH với EDC
Bước 2: PNS-SS-COOH sau khi hoạt hóa với EDC được phản ứng với CS-PEG
Hình 1.28. Phản ứng tổng hợp chất mang thuốc PNS@CS-PEG
1.7. Thử nghiệm độc tính tế bào (cytotoxicity test)
An toàn dược phẩm là yếu tố cực kỳ quan trọng. Việc thử nghiệm độc tính tế bào là bước đầu không thể thiếu đối với việc nghiên cứu 1 loại vật liệu dẫn truyền thuốc[32, 52, 53].
Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào.
Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hịa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM2.1. Hóa chất và thiết bị 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
Bảng 2.1. Tên hóa chất và nơi xuất xứ
Tên hóa chất Xuất xứ
Cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) Merck
1-Ethyl-3-(3-dimethylami
nopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)
Merck
Tetraethyl orthosilicate (TEOS) Merck
Gelatin Chitosan
Merck
Acid acetic Trung Quốc
Succinic anhydride Merck
Diethyl ether Merck
(3-aminopropyl)triethoxy silane (APTES) 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
Merck
Ethanol Tây Ban Nha
Tetrahydrofuran Merck
Màng cellulose 6000-8000 và 3000-5000 Da Merck
Dithiodipropionic acid (DTDP) Merck
4-Nitrophenyl chloromate Merck
Doxorubicin (DOX) Fluorouracile (5-FU) Sodium hydroxide Acid clohydric Merck Merck Trung Quốc Trung Quốc
Vỏ trấu sạch Miền Tây
2.1.2. Dụng cụ
Máy đánh siêu âm UP200Ht Máy cô quay Strike 300
Máy khuấy từ gia nhiệt Cân điện tử EB35B-Pro
Tủ sấy KETDNG 101 Máy tạo khí N2
Máy li tâm Máy đo pH AB15
Bình tam giác, cốc thủy tinh Phễu lọc, bình cầu
Phễu chiết, ống đong
Máy đo UV-vis
Giấy đo pH, giấy lọc.
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Tổng hợp nano silica xốp và tạo cầu nối biến tính
2.2.1.1. Tổng hợp vật liệu nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp sol-gel[54]
Nano silica xốp (porous nano silicas) được tổng hợp bằng phương pháp sol-gel sao cho kích thước hạt đồng đều dưới 100 nm. Sử dụng chất hoạt động bề mặt Cetyltrimethylamonium bromide (CTAB) như một tác nhân định hình cấu trúc lỗ xốp cho vật liệu nano, đây cũng có thể xem là khung sườn để TEOS có thể thủy phân và bao lấy tạo điều kiện cho việc hình thành các hạt nano silica xốp sau này.
Hình 2.1. Mơ tả qui trình tổng hợp Porous nano silica (PNS)
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp này như nhiệt độ, tốc độ khuấy, xúc tác, hàm lượng tetraethyl orthosilicate (TEOS), lượng nước...
Trên cơ sở đó, chúng tơi tiến hành khảo sát kích thước hạt dựa trên lượng NH3, TEOS, ethanol với tốc độ khuấy khoảng 350 vòng/phút, nhiệt độ 60oC.
Hình 2.2. Sơ đồ qui trình tổng hợp nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp sol-gel2.2.1.2. Tổng hợp vật liệu nano silica xốp bằng phương pháp kết tủa [55] 2.2.1.2. Tổng hợp vật liệu nano silica xốp bằng phương pháp kết tủa [55]
Xử lý nhiệt vỏ trấu
Vỏ trấu được làm sạch bằng nước sau đó được phơi khơ tự nhiên và được xử lý nhiệt trong lò nung ở 700oC trong 10 giờ. Sau khi xử lí nhiệt, sản phẩm thu được là tro trấu có màu trắng xám.
Hồ tan tro trấu
10g tro trấu sẽ được hồ tan bằng dung dịch NaOH có nồng độ 2N và được khuấy trên bể khuấy từ (nhiệt độ là 100oC) trong thời gian 1giờ 30phút đến 2 giờ. Sản phẩm sau khi hoà tan sẽ được lọc qua giấy lọc thu được dung dịch sodium silicate có màu vàng trong.
Trung hịa dung dịch sodium silicate
Dung dịch sodium silicate tiếp tục được trung hoà bằng dung dịch HCl có nồng độ 1,5N và được khuấy trên bể khuấy từ. Ở giai đoạn trung hoà pH của dung dịch được điều chỉnh trong khoảng (pH 6 – 6,5) đến khi xuất hiện kết tủa thì dừng khuấy.
Ly tâm tách chất rắn, sấy chân không thu được sản phẩm
Hỗn hợp sau khi trung hồ được cho vào ống nghiệm có nắp và ly tâm với tốc độ 4000 (vòng/phút) trong 20 phút để tách phần rắn. Sau đó, sẽ được rửa sạch bằng nước cất ba lần (mỗi lần 5 mL) và hai lần bằng ethanol (mỗi lần 5 mL). Tiếp đến, đông khơ trong 20 giờ để thu sản phẩm nano silica.
Trình tự thí nghiệm được mơ tả qua hình sau:
Nung Nghiền Trung hồ Đơng khơ Lọc
Hình 2.3. Qui trình tổng hợp nano silica xốp (PNS) bằng phương pháp kết tủa
Hồ tan
Ly tâm
2.2.1.3. Tạo cầu nối biến tínhTổng hợp PNS-GPTMS Tổng hợp PNS-GPTMS
PNS gắn với (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilane viết tắt là PNS-GPTMS với mục đích tạo nhóm hoạt hóa mạnh trên PNS để thuận tiện cho việc biến tính lên PNS. Trong cơng thức cấu tạo của (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) có vịng epoxid hoạt hóa rất mạnh. Phản ứng tạo cầu nối GPTMS được thực hiện như sau:
Đánh siêu âm hỗn hợp gồm 1(g) PNS-CTAB và 30 mL dung dịch toluene trong vịng 1giờ. Sau đó khuấy trong khoảng 30 phút ở nhiệt độ phịng trong mơi trường khí nitơ.
Thêm từ từ 1 mL (3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilane vào hỗn hợp, tiếp tục cho phản ứng trong 12 giờ trong mơi trường khí nitơ, ở nhiệt độ phịng.
Sau đó, tiến hành thẩm tách sản phẩm với màng cellulose (MW 6000-8000 Da) trong 250 mL hỗn hợp gồm acid acetic 2(M) và ethanol (1:1). Quá trình này thực hiện trong 5 lần. Sau đó đơng khơ và thu được sản phẩm dạng bột mịn.
Tổng hợp PNS-APTES
Các hạt nano PNS-APTES cũng được tổng hợp bằng phương pháp sol-gel, sử dụng APTES như nguồn cung cấp -NH2 cho bề mặt hạt nano silica xốp. Phương pháp tổng hợp