CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.2. Phương pháp thử hoạt tính enzyme amylase bằng phương pháp
khuếch tán trên thạch
* Phương pháp thu nhận enzyme amylase từ nấm sợi [3]
Sử dụng môi trường PGA không cho agar để nuôi cấy nấm sợi. - Chuẩn bị 100ml mơi trường trong bình tam giác 250ml. - Đem tiệt trùng ở 121ºC trong 30 phút và để nguội.
- Cho 10ml nước cất đã vô trùng vào trong ống nghiệm giống nấm sợi, khuấy nhẹ để các bào tử hòa trong nước.
- Đổ toàn bộ 10ml dịch trong ống nghiệm này vào trong bình tam giác 250ml có 100ml mơi trường.
- Đặt các bình tam giác này vào máy lắc có tốc độ 200 vịng/phút ni trong 48 giờ ở nhiệt độ phịng.
- Sau đó đem ly tâm, thu lấy dịch. Dịch ni cấy này có chứa enzyme hịa tan. Bảo quản dịch ni cấy này trong tủ lạnh 4ºC.
* Xác định hoạt tính enzyme Amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [3]
- Môi trường thử hoạt tính: Thạch (20g), tinh bột (1g), nước cất (1000ml).
- Các bước tiến hành:
+ Hấp tiệt trùng môi trường, phân vào các đĩa petri vô trùng, độ dày môi trường phải đảm bảo độ dày đồng đều nhau (3mm).
+ Dùng khoan nút chai vơ trùng có đường kính 10mm khoan mặt thạch tạo lỗ trống đường kính 10mm.
+ Nhỏ vào lỗ thạch 100µl dung dịch enzyme. + Đặt hộp petri ở nhiệt độ 7ºC trong 24 giờ.
+ Đặt hộp petri ở nhiệt độ 28 – 32ºC trong 24 giờ.
+ Tráng đều bề mặt thạch bằng một lớp Lugol, sau 15 phút đo đường kính vịng phân giải. Xác định hoạt tính enzyme bằng độ lớn vòng phân giải (D – d, mm).
Trong đó: D là đường kính vịng phân giải (mm). d là đường kính lỗ thạch (mm).
2.3.2.3. Phương pháp khảo sát khả năng đường hóa trong q trình lên men rượu của hai chủng nấm sợi Mucor spp. và Rhizopus oryzae
* Phương pháp thí nghiệm [10]:
- Gạo trắng: cân 50g/ bình tam giác 250ml. - Ngâm ở nhiệt độ phòng trong 4 – 5 giờ. - Đo pH sau khi ngâm.
- Cấy chủng sợi đã được nuôi trên môi trường PGA trong 3 ngày (1 đĩa petri nấm sợi/ bình tam giác).
- Ủ ở 30ºC trong 72 giờ.
- Thu hoạch và phân tích các chỉ tiêu.
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) lặp lại 3 lần, mỗi nghiệm thức 3 bình tam giác.
* Các chỉ tiêu phân tích:
- pH: Đo bằng pH kế WTW pH 525.
- Ước tính tổng số lượng đường khử: Bằng cách đo độ Brix.
- Xác định hàm lượng glucose: Bằng kit thử glucose oxidase (Megazyme
– glc 9/96).
- Xác định hàm lượng đường khử: Bằng phương pháp Bertrand [10], [19].
+ Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng oxy hóa – khử giữa đường với các ion kim loại để xác định lượng monosaccharide và disaccharide.
+ Chuẩn bị các dung dịch có thành phần sau (gam/lít): (ddA): CuSO4.5H2O 40 (ddB): Muối K – Na Tatrat 200 NaOH 150 (ddC): Fe2(SO4)3.H2O 50 H2SO4 đặc (d = 1,84) 200 (ddD): KMnO4 N/6 0,53 + Các bước tiến hành:
Lấy: 3ml dịch lên men cần thử, 3ml ddA, 3ml ddB trộn đều, đun cách thủy đến sôi và giữ 6 – 8 phút.
Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút trong 5 phút, loại bỏ dịch ly tâm, thu hồi cặn kết lắng.
Thêm vào 9ml nước cất, lắc đều.
Tiếp tục ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút trong 5 phút, loại bỏ dịch ly tâm, thu hồi cặn.
Thêm 3ml ddC vào cho đến khi kết tủa hoàn toàn.
Chuẩn độ với ddD cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt.
Tính số lượng đường khử: cứ 1ml KMnO4 = 1mg Cu, dựa vào lượng Cu, tra bảng đường khử tính được lượng đường khử.
2.3.3. Phương pháp sản xuất bánh men rượu
2.3.3.1. Quy trình sản xuất bột nấm sợi (bột mốc)
Chủng nấm sợi thuần 90% bắp mảnh, nhuyễn + 10% trấu được tuyển chọn
Bổ sung khống, nước Cấy trong mơi trường PGA, (tạo độ ẩm 50%), ngâm 1 giờ nuôi cấy 5 ngày ở 30 - 32ºC
Hấp khử trùng ở 121ºC trong Chủng nấm sợi thuần 1 giờ, để nguội 35 - 40ºC
Trộn khuẩn ty, bào tử nấm sợi, bắp trấu (Ủ ở 30ºC trong 5 ngày)
Sấy ở 42ºC trong 24 giờ
Xay
2.3.3.2. Xác định tỉ lệ bột nấm sợi (bột mốc) tối ưu cho q trình đường hóa
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện với sự thay đổi tỉ lệ bột nấm sợi để đánh giá sự ảnh hưởng của tỉ lệ bột nấm sợi phối trộn vào nguyên liệu đến hoạt tính đường hóa của bột nấm sợi. Thí nghiệm với tỉ lệ bột nấm sợi (% w/w) lần lượt là: 0,5%, 0,75%, 1%. Với mỗi tỉ lệ lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi: Độ Brix sau khi ủ, thể tích dịch rỉ.
Cách tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Cơng nghệ Bình Định theo sơ đồ như sau:
Gạo (50g/ bình tam giác)
Ngâm 4 – 5 giờ
Hấp chín
Để nguội 35 - 40ºC
0,5% 0,75% 1%
Ủ hiếu khí (30ºC trong 3 ngày)
Giống men thuần gồm chủng nấm men Saccharomyces sp2 và chủng nấm sợi Mucor spp.
2.3.3.3. Quy trình sản xuất men rượu thuần
Chọn gạo tốt
Phơi khô, nghiền mịn
Thuốc bắc Phối trộn
Thêm nước tạo độ ẩm 55 – 60%
Tạo hình
Xếp vào khay có trải một lớp trấu,
để ở nhiệt độ phịng, thống gió từ 4 – 10 ngày
Men rượu thuần
Ghi chú: Thuốc bắc gồm 8 thành phần: Nhục đậu khấu (3g), cam thảo (3g), bạch truật (2g), bạc hà (2g), nhục quế (2g), tế tân (3g), thảo quả (3g), tiểu hồi (3g).
2.3.4. Phương pháp đánh giá năng suất, chất lượng rượu lên men giữa men rượu thuần và men rượu thị trường tại làng nghề men rượu thuần và men rượu thị trường tại làng nghề
Để đánh giá năng suất, chất lượng lên men rượu giữa men rượu thuần và men rượu thị trường, chúng tôi tiến hành chưng cất rượu theo phương pháp truyền thống ở Bình Định và thực hiện tại hộ Nguyễn Thị Năm và hộ Lê
Nghiền mịn Nghiền mịn
Mạnh Hưng thuộc làng Bàu Đá – Xã Nhơn Lộc – Thị xã An Nhơn – Tỉnh Bình Định.
Bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần theo sơ đồ sau: Gạo (7kg)
Ngâm 4 – 5 giờ
Hấp chín
Để nguội 35 – 40ºC
Trộn men thuần (1,5%)
Ủ hiếu khí (30ºC trong 3 ngày)
Chan nước (15 lít)
Ủ yếm khí (30ºC trong 4 ngày) Chưng cất
Phối chế
2.3.5. Phương pháp cảm quan
Sau khi chưng cất rượu từ men tạo được tại làng Bàu Đá – Xã Nhơn Lộc – Thị xã An Nhơn – Tỉnh Bình Định thì tiến hành điều tra bằng phiếu đánh giá cảm quan rượu. Đầu tiên là chuẩn bị mẫu thử và kiểm tra cảm quan theo TCVN 8007: 2009, sau đó phân tích cảm quan và phương pháp cho điểm rượu theo TCVN 3217 – 1979 để đánh giá, so sánh chất lượng rượu thu được và mẫu đối chứng ở địa phương.
2.3.5.1. TCVN 8007 : 2009 về chuẩn bị mẫu thử và kiểm tra cảm quan rượu
* Chuẩn bị mẫu thử:
Từ loại rượu đã chưng cất được và rượu đối chứng ở địa phương, lắc đều, từ mỗi loại lấy một lượng như nhau, sao cho có được lượng mẫu trung bình là 2 lít. Trộn đều rồi chia thành 2 phần bằng nhau, một phần để lưu mẫu, phần cịn lại được dùng để phân tích [21].
Mẫu được đựng trong chai khơ, sạch, có dán nhãn, ghi rõ tên cơ sở sản xuất, tên loại men, ngày sản xuất. Mẫu lưu được bảo quản 6 tháng kể từ ngày lấy mẫu [21].
* Kiểm tra cảm quan:
- Yêu cầu chung: Khu vực thử các chỉ tiêu cảm quan phải thống, khơng có mùi lạ, xa khu vực thử nghiệm hóa học [21].
- Xác định dạng bên ngoài: Kiểm tra nhãn, bao bì đựng chai và chai sản phẩm, sau đó kiểm tra độ vẩn đục và tạp chất lạ [21].
- Xác định độ trong: Dùng 3 ống thủy tinh khơng màu có đường kính và chiều dài bằng nhau. Rót vào 1 ống 20ml nước cất, 1 ống đựng rượu thí nghiệm và ống cịn lại đựng rượu đối chứng. Đặt 3 ống trên nền trắng dưới ánh sáng thường để so sánh màu sắc và độ trong [21].
- Xác định mùi vị: Rót 50ml mỗi loại rượu vào 2 cốc thử, dung tích 150ml, sau đó ngửi và nếm để xác định mùi vị. Các cốc đó đã được tráng
bằng nước cất và rượu mẫu thử nghiệm ngay sau đó tiến hành kiểm tra mùi, vị [21].
Khơng được thử quá 3 mẫu. Thử nếm để so sánh các mẫu với nhau. Sau khi cảm quan xong một mẫu phải nghỉ từ 5 – 10 phút. Trong thời gian nghỉ, phải súc miệng bằng nước đã đun sơi để nguội khơng có mùi, vị lạ và dùng những thức ăn không ảnh hưởng đến vị giác để đưa cảm giác trở lại bình thường [21].
* Tiến hành thử: Sau khi kiểm tra, đánh giá và cho điểm theo TCVN 3217 – 1979
2.3.5.2. TCVN 3217 – 1979 về phân tích cảm quan và phương pháp cho điểm rượu điểm rượu
* Tính số điểm chưa có trọng lượng của từng mẫu rượu:
Số điểm chưa có trọng lượng là số điểm cho tương ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu chất lượng và được quy định trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Điểm chưa có trọng lượng của các chỉ tiêu về rượu [18]
Tên chỉ tiêu Điểm chưa có trọng lượng Yêu cầu Độ trong và màu sắc
5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, màu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chất lỏng trong suốt, khơng vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, màu đặc trưng cho sản phẩm.
3
Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm.
màu khác nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm.
1 Chất lỏng đục, nhiều cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc trưng cho sản phẩm. 0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng.
Mùi 5 Hòa hợp, thơm dịu, đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chưa hồn tồn hịa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khó nhận thấy.
3 Hơi nồng, có mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm.
1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm.
0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Vị
5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chưa hồn tồn hịa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho sản phẩm bình thường.
3 Chưa hòa hợp, hơi gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm.
2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm.
1 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hỏng.
2.3.6. Phương pháp hóa lý
2.3.6.1. Phương pháp xác định hàm lượng ethanol
Hàm lượng ethanol (% thể tích) ở 200C được xác định theo phương pháp thử nghiệm TCVN 8010: 2009.
2.3.6.2. Phương pháp xác định hàm lượng methanol
Hàm lượng methanol (mg/l) được xác định theo phương pháp thử nghiệm theo TCVN 8010:2009.
2.3.6.3. Phương pháp xác định hàm lượng aldehyde
Hàm lượng aldehyde (mg acetaldehyde/l ethanol 1000C) được xác định theo phương pháp thử nghiệm TCVN 8009: 2009.
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phương pháp thống kê sinh học, phần mềm Excel 2010, phần mềm Statgraphics centurion XV.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG NẤM SỢI Mucor
spp. VÀ CHỦNG NẤM SỢI Rhizopus oryzae
Cấy chủng nấm sợi lên môi trường PGA, để ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sau khi quan sát khuẩn lạc của hai chủng nấm sợi, làm tiêu bản nhuộm với xanh methylen đã ghi nhận được một số đặc điểm của hai chủng nấm sợi như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số đặc điểm của chủng nấm sợi Mucor spp. và chủng nấm sợi Rhizopus
oryzae
Đặc điểm Mucor spp. Rhizopus oryzae
Đặc điểm khuẩn lạc
Khuẩn lạc dạng len, thưa, mịn, màu xám tro.
Khuẩn lạc phát triển nhanh, phủ kín bề mặt cơ chất, dạng bông dày, tạo thành lớp mốc xám.
Hình dạng sợi nấm
Sợi nấm màu đen, khơng có vách ngăn, không phân nhánh, bên dưới khơng có rễ giả. Cuống bào tử màu trắng khơng có vách ngăn.
Sợi nấm cịn non màu trắng xám khi già có màu xám lơng chuột, khơng có vách ngăn, phân nhánh nhiều, bên dưới có rễ giả, có thân bị. Cuống bào tử màu trắng khơng có vách ngăn.
Cơ quan sinh sản
Dạng túi, bề mặt nhẵn. Túi bào tử kín, hình cầu phồng to, bên trong chứa rất nhiều bào tử. Bào tử hình cầu màu đen.
Túi bào tử kín hình cầu. Bào tử hình cầu, cịn non màu xám, già chuyển sang màu đen.
khuẩn lạc (sau 48 giờ nuôi cấy)
Tốc độ phát
triển Nhanh Nhanh
a)
b)
Hình 3.1. Khuẩn lạc chủng nấm sợi Mucor spp. (kí hiệu mốc 1) và chủng nấm sợi
Rhizopus oryzae (kí hiệu mốc 2) ni cấy 48 giờ trong mơi trường PGA
Hình 3.2. Khuẩn ty, túi bào tử và tiêu bản nhuộm xanh methylen chủng nấm sợi
Mucor spp.
Hình 3.3. Khuẩn ty, túi bào tử và tiêu bản nhuộm xanh methylen chủng nấm sợi
Rhizopus oryzae
3.2. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG NẤM SỢI Mucor spp. VÀ Rhizopus oryzae 3.2.1. Hàm lượng NaNO3 trong môi trường Czapek – Dox tối ưu cho sự
sinh trưởng của chủng nấm sợi Mucor spp. và chủng nấm sợi Rhizopus
oryzae
Để xác định hàm lượng NaNO3 trong môi trường nuôi cấy tối ưu cho sự sinh trưởng của nấm sợi, tiến hành cấy điểm hai chủng nấm sợi trên môi trường Czapek – Dox nhưng thay đổi nồng độ NaNO3 lần lượt là 1,0g/l, 1,5g/l, 2,0g/l, 2,5g/l, 3,0g/l. Theo dõi sự phát triển, đo đường kính khuẩn lạc định kỳ 24 giờ một lần và xác định thời gian để khuẩn lạc của các chủng nấm sợi phủ kín bề mặt đĩa petri có đường kính 8cm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2, bảng 3.3 và biểu đồ 3.1.
Bảng 3.2. Đường kính khuẩn lạc của các chủng nấm sợi khi ni cấy trong mơi trường Czapek – Dox có thay đổi hàm lượng NaNO3
Hàm lượng NaNO3 trong môi trường nuôi
cấy (g/l)
Đường kính khuẩn lạc (mm)
Mucor spp. Rhizopus oryzae
24 giờ 48 giờ 72giờ 24 giờ 48giờ 72 giờ
1,0 25,0 54,67 75,0 23,0 50,0 70,0
1,5 27,0 62,33 80,0 25,67 53,33 72,67
2,0 32,33 66,33 80,0 31,33 60,0 79,0
2,5 28,33 63,0 80,0 24,67 54,0 75,33
3,0 24,33 57,0 78,33 24,33 52,0 73,33
Ghi chú: Giá trị đường kính khuẩn lạc là giá trị trung bình của ba lần lặp lại.
Bảng 3.3. Thời gian để khuẩn lạc của các chủng nấm sợi phủ kín bề mặt đĩa petri khi ni cấy trong mơi trường Czapek – Dox có thay đổi hàm lượng NaNO3
Hàm lượng NaNO3 trong môi trường nuôi
cấy (g/l)
Thời gian khuẩn lạc mọc kín đĩa petri (giờ)
Mucor spp. Rhizopus oryzae
1,0 75,17 80,17
1,5 70,58 78,5
2,0 68,25 72,17
2,5 70,33 76,5
3,0 73,92 78,83
Biểu đồ 3.1. Thời gian để khuẩn lạc của các chủng nấm sợi phủ kín bề mặt đĩa petri khi ni cấy trong mơi trường Czapek – Dox có thay đổi hàm lượng NaNO3
Qua bảng 3.2, bảng 3.3 và biểu đồ 3.1 ta thấy ở cơng thức thí nghiệm với hàm lượng NaNO3 trong môi trường Czapek – Dox là 2,0g/l, hai chủng nấm sợi phát triển nhanh nhất.
- Đường kính khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy đạt 32,33mm đối với chủng Mucor spp. và 31,33mm đối với chủng Rhizopus oryzae.
- Đường kính khuẩn lạc sau 48 giờ nuôi cấy đạt 66,33mm đối với chủng Mucor spp. và 60,0mm đối với chủng Rhizopus oryzae.
- Đường kính khuẩn lạc sau 72 giờ ni cấy đạt 80,0mm đối với chủng
Mucor spp. và 79,0mm đối với chủng Rhizopus oryzae.
- Thời gian để khuẩn lạc phủ kín mặt đĩa là 68,25 giờ đối với chủng
Mucor spp. và 72,17 giờ đối với chủng Rhizopus oryzae.
Như vậy, qua kết quả xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics centurion XV với độ tin cậy 95,0% ta thấy ở công thức sử dụng hàm lượng NaNO3 là 2,0g/l các chủng nấm sợi phát triển nhanh hơn và thời gian để khuẩn lạc phủ kín bề mặt đĩa petri ngắn hơn các công thức còn lại. Sự sai khác này có ý nghĩa thống kê (P – value < 0,05) vì vậy ta có thể kết luận: