Hình 1.6. Cơ chế SPE phân tích mẫu trong dung mơi khác nƣớc
Các bước thực hiện:
Hình 1.7. Các bƣớc thực hiện của phƣơng pháp SPE
Chọn cột chiết pha rắn: tùy thuộc kiểu chiết mô tả ở trên, thể tích mẫu, mức
độ tạp chất, mà chọn cột có thể tích, lƣợng và loại pha tĩnh khác nhau.
Luyện cột: cho dung môi đi qua chất hấp thu để thấm ƣớt và solvat hóa các
nhóm chức, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là dung mơi.
Nạp mẫu vào cột chiết: chuyển mẫu lên cột, sau đó sử dụng áp suất giảm
hoặc để mẫu tự chảy.
Rửa loại tạp chất: đây là giai đoạn rửa giải cá tạp chất. Điều quan trọng
nhất của q trình này là chất phân tích khơng đƣợc tan trong dung dịch rửa.
Rửa giải chọn lọc lấy chất phân tích: dùng dung mơi thích hợp để lấy chất
cần phân tích.
* Áp dụng và ưu nhược điểm: một số tác giả đã sử dụng kỹ thuật SPE để chiết
và làm sạch hóa chất BVTV trong rau quả. Ƣu điểm là lƣợng dung môi sử dụng thƣờng nhỏ (< 10 ml), thời gian chiết nhanh, tỷ lệ thu hồi cao, không tạo nhũ tƣơng, độ lặp lại tốt. Tuy nhiên cột SPE nhồi sẵn có giá thành tƣơng đối cao.
Các tác giả Fillion (2000) [37] đã sử dụng cột C18 và aminopropyl để làm sạch các thuốc trừ sâu dạng OP trong rau quả, hiệu suất thu hồi đạt 80% đến
125%. Cook (1990) [33] đã sử dụng cột C18 để làm sạch các OP trong mẫu nho, cam, xà lách, cà chua, hiệu suất thu hồi đạt 82% đến 112%. Alvin Chai L.K. và Lau Seng (2004) [27] đã sử dụng cột C18 để làm sạch các OP trong các mẫu rau cải, dƣa chuột và đậu xanh với hiệu suất thu hồi đạt 71% đến 107%.
1.3.7.3. Vi chiết pha rắn (SPME)
Nguyên tắc: SPME là quá trình chiết và tự làm giàu một cách chọn lọc chất
phân tích khơng phân cực từ mẫu lỏng phân cực lên pha tĩnh lỏng không phân cực phủ trên bề mặt sợi vi chiết. SPME là quá trình chiết đạt tới cân bằng tuân theo định luật phân bố, trong q trình chiết thì mẫu ln đƣợc khuấy trộn [24][39]
Thiết bị: Sợi làm bằng silica nung chảy phủ lớp pha tĩnh mỏng (carbowax,
PDMS), đặt trong lịng một chiếc kim gắn với một pít - tông làm bằng thép không gỉ. Tổ hợp này đƣợc đặt trong bộ phận bảo vệ (sy-ranh).
Hình 1.8. Mơ hình phƣơng pháp SPME
Áp dụng và ưu nhược điểm: ban đầu SPME đƣợc áp dụng để chiết các chất cơ
clo trong môi trƣờng [53]. Gần đây SPME đã đƣợc áp dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ dƣợc phẩm, sinh học… Ƣu điểm của phƣơng pháp là rất nhạy, không sử dụng
Các tác giả Magdic S., Pawliszyn J (1996) [53] đã xây dựng thành công phƣơng pháp vi chiết pha rắn để chiết 8 loại thuốc trừ sâu cơ clo ra khỏi nƣớc với khoảng nồng độ của các chất 0,001ng/ml đến 100ng/ml. Độ lặp lại của phƣơng pháp rất tốt với độ chính xác giữa các lần đo dƣới 20% RSD.
1.3.8. Phƣơng pháp phân tích định tính và định lƣợng [25]
a, Định tính:
Có thể dựa vào thời gian lƣu (tR), sử dụng các detecto có tính chọn lọc nhƣ ECD, NPD, FPD hay dùng detecto khối phổ để định tính các chất.
b, Định lượng:
* Chuẩn hóa diện tích: chuẩn hóa theo diện tích là cách tính theo tỷ lệ phần
trăm diện tích pic đƣợc coi tƣơng ứng với tỷ lệ phần trăm trọng lƣợng. Phƣơng pháp này không sử dụng trong phân tích dƣ lƣợng.
* Ngoại chuẩn: tiến hành sắc ký mẫu thử song song và đồng thời với dung
dịch chuẩn (chuẩn 1 điểm) hoặc dựng đƣờng chuẩn. Hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu thử đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn.
* Nội chuẩn: phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng khi độ lặp lại của hệ
thống không tốt hoặc hệ thống khơng đƣợc chuẩn hóa thƣờng xun. Sau khi tiến hành sắc ký, đƣờng chuẩn đƣợc xác định dựa vào tỷ số giữa diện tích pic các chất chuẩn và chất nội chuẩn, nhƣ vậy các sai số về thể tích đƣợc loại bỏ.
* Thêm chuẩn: chất chuẩn giống nhƣ chất cần phân tích đƣợc thêm vào mẫu
thử. Thêm chuẩn thƣờng nhằm hai mục đích: làm tăng độ nhạy của phƣơng pháp hoặc khảo sát độ đúng của phƣơng pháp.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG P ƢƠNG TIỆN VÀ P ƢƠNG P P NG IÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Hiện nay, nhiều ngƣời nông dân đã lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật làm cho dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật trong nhiều mẫu rau vƣợt giới hạn cho phép hàng chục lần; nhất là các loại rau ăn lá nhƣ: cải ngọt, mồng tơi, cải bẹ xanh, cải bắp, dƣa leo… Dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật trong các loại rau quả quá cao đã gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời, là nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Do đó, đối tƣợng nghiên cứu là một số loại rau nhƣ rau, củ, quả. Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời dƣ lƣợng các thuốc trừ sâu cơ phốt pho trong rau, quả bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS).
Trong luận văn này, chúng tôi sẽ tiến hành xác định các loại thuốc trừ sâu hữu cơ là Methyl parathion (Vofatox) và Parathion (Thiophot) là chính, bởi vì hai loại thuốc này vẫn đƣợc sử dụng khá phổ biến và có ảnh hƣởng rất lớn đến môi trƣờng cũng nhƣ sức khỏe con ngƣời.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau:
2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp
a) Khảo sát phƣơng pháp bao gồm: - Điều kiện chạy sắc ký GC/MS - Điều kiện tách chiết mẫu b) Thẩm định phƣơng pháp:
- Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ - Khoảng tuyến tính
- Độ chụm (độ lặp lại)
2.1.2.2. Ứng dụng phƣơng pháp trong phân tích mẫu thật
Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật cơ phốt pho trong một số loại rau và quả trên địa bàn Hà Nội.
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị 2.2.1. Thiết bị
a, Máy SKK Agilent 6890 plus
b, Máy ly tâm Hettich 220 R
c, Dụng cụ SPE
Hình 2.1. Các thiết bị và dụng cụ cơ bản sử dụng trong nghiên cứu
Hệ thống sắc ký khí GC 6790 Plus và detector MS 5790 Agilent.
Máy lắc vortex.
Máy đồng nhất mẫu Ultra Turax T25.
Máy li tâm Hettich.
Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg).
Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).
Máy cất quay chân không Buchi.
Bộ chiết pha rắn
2.2.2. Dụng cụ
Ống li tâm 50ml
Cột chiết pha rắn C18 Bond Elute Agilent
Vial loại 1,8ml.
Pipet pasteur.
Ống đong, phễu, giấy lọc.
2.2.3. Dung mơi hóa chất
Các loại hố chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết của Merk.
Chuẩn OPs gồm: Thionazin, Sulfotep, Phorate, Disulfoton, Methyl parathion, Parathion của hãng Dr. Ehrenstorfer GmbH, Đức.
Methanol
n-hexan
Diclometan
Ete dầu hỏa
Toluen
Na2SO4
NaCl
Nƣớc cất 2 lần, deion.
2.3. Xây dựng các qui trình xử lý mẫu để phân tích các hóa chất BVTV 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
Áp dụng TCVN 5139 : 2008 và tham khảo thêm quy định của Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn về phƣơng pháp lấy mẫu [3],[18].
Quá trình lấy mẫu dựa vào mục đích của q trình phân tích để chọn phƣơng thức lẫy mẫu, vận chuyển và bảo quản, đảm bảo mẫu là đại diện. Quá trình phân tích trở nên khơng có ý nghĩa và khó lý giải nếu q trình lấy mẫu khơng tn thủ các nguyên tắc lấy mẫu hoặc sơ xuất trong q trình lấy mẫu.
Ngƣời phân tích có thể lấy mẫu ngồi cánh đồng hoặc lấy mẫu lơ hàng. Nếu lấy mẫu lơ hàng thì mẫu phải đại diện cho một lơ hàng. Mục đích của q trình lấy
mẫu này là kiểm tra mức dƣ lƣợng hóa chất BVTV có vƣợt q MRLs khơng. Trong quá trình lấy mẫu tránh làm nhiễm bẩn.
Mẫu lấy ngẫu nhiên ở các vị trí khác nhau. Mẫu đƣợc đựng trong túi PE sạch, mã hóa và mang về bảo quản trong tủ lạnh ở dƣới 5o
C.
2.3.2. Phƣơng pháp phân tích mẫu
(a) Lựa chọn phương pháp: Tùy theo tính chất của đối tƣợng nghiên cứu (rau, quả)
và của đối tƣợng phân tích (hóa chất BVTV) mà sử dụng phƣơng pháp xử lý mẫu thích hợp.
- Chiết, làm sạch và làm giàu đối tƣợng phân tích: + Chiết đối tƣợng phân tích bằng dung mơi hữu cơ.
+ Nếu dung mơi chiết ít hoặc khơng phân cực, làm sạch và làm giàu đối tƣợng phân tích bằng phƣơng pháp chiết pha rắn SPE sử dụng Silica hoặc Florisil.
+ Nếu dung mơi chiết phân cực hoặc trung bình, làm sạch và làm giàu đối tƣợng phân tích bằng phƣơng pháp chiết pha rắn SPE trên cột C18.
- Kỹ thuật bổ trợ làm tăng hiệu quả chiết: nhiệt độ (chiết nóng cách thủy, chiết Soxhlet); siêu âm; ly tâm; khuấy trộn siêu tốc; vi sóng hỗ trợ…
(b), Một số thực nghiệm khảo sát:
- Khảo sát lựa chọn dung môi chiết: acetonitril và aceton. Khảo sát so sánh hiệu suất chiết trên mẫu thử đƣợc thêm chuẩn.
- Khảo sát so sánh dung môi rửa giải về hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn khi qua cột là hexan : petroleum ete (1:1); acetone : petroleum ete (1:1); hexan : aceton (5:1).
- Cách tiến hành khảo sát hiệu suất thu hồi trên mẫu chuẩn khi cho qua cột: chuyển 6 ml dung dịch chuẩn có chứa các chất phân tích (pha trong nền mẫu trắng - dƣa chuột) cần khảo sát vào cột. Để dịch chảy tự nhiên, sau đó rửa giải với các dung môi cần khảo sát. Thu hồi dung môi rửa giải, chia thành 2 đến 3 phân đoạn và hứng vào các ống nghiệm khác nhau. Làm bay hơi bằng khí nitơ tới cặn. Hòa tan cắn trong 1 ml n-hexan và chạy theo chƣơng trình sắc ký đã chọn.
- Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn khi qua cột sẽ ghi đƣợc số ml dung môi rửa giải đủ để lấy hết chất phân tích và dung mơi rửa giải thích hợp.
(c), Đánh giá phương pháp chiết và làm sạch: dựa vào hiệu suất chiết (tỷ lệ)
thu hồi (%R) trên mẫu nhiễm. Mẫu nhiễm đƣợc tạo ra từ mẫu trắng bằng phƣơng pháp thêm chuẩn. Chiết và làm sạch mẫu nhiễm theo phƣơng pháp đã nêu, phân tích bằng sắc ký xác định hiệu suất thu hồi.
Phân tích sắc ký định tính và định lƣợng hóa chất BVTV
2.3.3. Quy trình phân tích mẫu
Xây dựng quy trình chiết và làm sạch hóa chất BVTV trong mẫu rau quả
2.3.3.1. Chiết mẫu [8][11][12][23][24][27][31][35][50]:
Cân 10g mẫu (m) chính xác tới 0,1mg vào ống ly tâm. Cho vào 40 ml acetone (V1), đồng nhất bằng thiết bị Ultra-Turrax với tốc độ 13500 vòng/phút trong 3 phút. Thêm lần lƣợt 20ml petroleum ether (V2), 20ml dichloromethane (V3) và cho 10g natri sulphat khan, đồng nhất 1 phút, ly tâm 30 phút ở tốc độ 5000 vòng/phút. Lƣu dịch chiết.
2.3.3.2. Làm sạch dịch chiết bằng SPE pha đảo[8][11][12][23][27][32][33][37]:
Sử dụng cột SPE C18: đổ 10 ml dung môi n-hexan cho chảy qua cột với tốc độ 1 ml/phút. Chuyển 8 ml dịch chiết (V4) trên cho vào cột đã hoạt hóa. Để dịch chảy tự nhiên, sau đó dùng 10 ml hỗn hợp dung môi n-hexan : acetone (5:1) (chia làm 2 lần) để rửa giải. Thu hồi dịch rửa giải, làm bay hơi dƣới luồng khí nitơ ở nhiệt độ 30
o
C tới cắn. Hòa tan cắn trong 1 ml n-hexan (VE) rồi đem phân tích bằng GC-MS.
2.3.3.3. Tính tốn kết quả
Dùng đƣờng chuẩn để tính nồng độ của mẫu thử khi bơm vào máy (Cm) Dƣ lƣợng từng hóa chất thuốc BVTV (C) trong mẫu đƣợc tính theo cơng thức:
P m V V V V V C kg mg C E m 4 3 2 1 ) ( ) / ( Trong đó:
VE: Thể tích cuối dung dịch mẫu thử, ml V1: Thể tích dung mơi acetone, ml
V2 : Thể tích dung mơi petroleum ether , ml V3 : Thể tích dung mơi dichloromethane, ml
V4: Thể tích pha hữu cơ đƣợc lấy ra để làm sạch, ml m : Khối lƣợng mẫu thử, g
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ T ẢO LUẬN 3.1. Tối ƣu các điều kiện xác định OPs bằng GC-MS
3.1.1. Chọn điều kiện bơm mẫu
Dựa vào các tài liệu tham khảo [38],[39],[42],[53],[58],[59] với hệ thống GC 6890 Plus ghép nối với khối phổ MS 5973N (Agilent), để phù hợp cấu hình máy và đạt đƣợc yêu cầu về độ chính xác, độ lặp lại của thiết bị, phù hợp với phân tích xác định dƣ lƣợng các hóa chất BVTV trong rau quả ở hàm lƣợng vết, chúng tơi chọn thể tích bơm mẫu là 2 µl, chọn chế độ tiêm khơng chia dịng (splitless).
Nhiệt độ cổng tiêm đƣợc lựa chọn là 250oC theo [25],[40],[41],[59] đảm bảo mẫu có thể phân hủy bởi nhiệt độ. Hơn nữa nhiệt độ buồng bơm quá cao có thể ảnh hƣởng đến độ bền của đệm cao su (septum) gây hở khí và làm ảnh hƣởng đến độ ổn định của phƣơng pháp và độ chính xác của kết quả. Dung môi sử dụng để pha các mẫu chạy sắc ký đƣợc chọn là n-hexan do nó có khả năng tăng cƣờng đƣợc hiệu quả của hiệu ứng dung mơi.
3.1.2. Chọn cột tách
Cột tách góp một phần khá quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có độ phân giải tốt hay khơng. Để chọn loại cột có pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích. Theo các tài liệu [25],[40],[41],[53],[59] với các đối tƣợng cần tách là các hóa chất BVTV nhóm phốt pho hữu cơ, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cột Agilent DB-5ms Ultra Inert GC Column 15 mm x 0,25 mm x 0,25 µm để nghiên cứu.
3.1.3. Chọn chƣơng trình nhiệt độ của buồng cột
Chƣơng trình nhiệt độ của cột phân tích phụ thuộc vào các yếu tố sau: - Nhiệt độ giới hạn trên của cột phân tích
- Nhiệt độ sơi của cấu tử cần phân tích
- Độ phức tạp của mẫu: số lƣợng các cấu tử nhiều hay ít, nhiệt độ sôi xấp xỉ hay khác xa nhau.
Bảng 3.1. Chƣơng trình nhiệt độ cho nhóm OP TT Nhiệt độ cột GC TT Nhiệt độ cột GC
(oC)
Tốc độ tăng nhiệt độ
(oC/phút)
Thời gian duy trì
(phút)
1 70 0 2
2 150 25 0
3 250 5 5
3.1.4. Lựa chọn các thông số cho detecto khối phổ MSD 5973N
Theo các thông số cài đặt của nhà sản xuất Agilent và các tài liệu tham khảo [8],[11],[25],[38],[41],[42],[60] chúng tôi chọn các thông số nhƣ sau: nhiệt độ nguồn ion 230oC; Năng lƣợng ion hóa Ei 70 eV; Detector gain 1,2 kV; Thời gian ngắt dung môi 7 phút; Chế độ TIC: quét các ion trong khoảng m/z: 50 đến 550 amu; Chế độ SIM hoặc SCAN. Nhiệt độ kết nối (interface): 250oC (chúng tôi sẽ khảo sát ở mục 3.1.6)
3.1.5. Khảo sát tốc độ khí mang Heli
Căn cứ vào tài liệu của hãng Agilent và tài liệu tham khảo [53],[55],[60], chúng tôi đã tiến hành khảo sát tốc độ khí mang Heli (99.999%) ảnh hƣởng đến thời gian lƣu và diện tích pic ở các mức 1,0 ml/phút, 1,2 ml/phút và 1,4 ml/phút.
Các hoạt chất thuốc trừ sâu cơ phốt pho bao gồm: Thiazinon, Sulfotep, Phorate, Disulfoton, Methyl parathion và Parathion đƣợc chọn để khảo sát.
Với các điều kiện đã chọn cho thiết bị GC theo mục 3.1.1 đến 3.1.4 chúng tôi tiến hành khảo sát với dung dịch hỗn hợp chuẩn của các OP 1000ppb. Kết quả thu đƣợc nhƣ trong các hình 3.1 đến 3.5.
8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 7 0 0 0 8 0 0 0 9 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 2 0 0 0 1 3 0 0 0 1 4 0 0 0 1 5 0 0 0 1 6 0 0 0 1 7 0 0 0 1 8 0 0 0 1 9 0 0 0 2 0 0 0 0 2 1 0 0 0 2 2 0 0 0 2 3 0 0 0 2 4 0 0 0 Ti me - - > Ab u n d a n c e TI C : OPS0 7 0 9 5 . D 8 . 3 9 8 . 6 6 9 . 4 6 9 . 8 0 1 0 . 3 7 1 1 . 7 4 1 3 . 1 8 1 3 . 8 0 1 4 . 9 1 1 7 . 3 7 2 0 . 5 5
Hình 3.1. Sắc đồ hỗn hợp chuẩn OPs 1000ppb với tốc độ khí 1,0 ml/phút
8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0