Hệ thống sắc ký khí GC 6790 Plus và detector MS 5790 Agilent.
Máy lắc vortex.
Máy đồng nhất mẫu Ultra Turax T25.
Máy li tâm Hettich.
Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg).
Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).
Máy cất quay chân không Buchi.
Bộ chiết pha rắn
2.2.2. Dụng cụ
Ống li tâm 50ml
Cột chiết pha rắn C18 Bond Elute Agilent
Vial loại 1,8ml.
Pipet pasteur.
Ống đong, phễu, giấy lọc.
2.2.3. Dung mơi hóa chất
Các loại hố chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết của Merk.
Chuẩn OPs gồm: Thionazin, Sulfotep, Phorate, Disulfoton, Methyl parathion, Parathion của hãng Dr. Ehrenstorfer GmbH, Đức.
Methanol
n-hexan
Diclometan
Ete dầu hỏa
Toluen
Na2SO4
NaCl
Nƣớc cất 2 lần, deion.
2.3. Xây dựng các qui trình xử lý mẫu để phân tích các hóa chất BVTV 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
Áp dụng TCVN 5139 : 2008 và tham khảo thêm quy định của Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn về phƣơng pháp lấy mẫu [3],[18].
Quá trình lấy mẫu dựa vào mục đích của q trình phân tích để chọn phƣơng thức lẫy mẫu, vận chuyển và bảo quản, đảm bảo mẫu là đại diện. Quá trình phân tích trở nên khơng có ý nghĩa và khó lý giải nếu q trình lấy mẫu khơng tn thủ các nguyên tắc lấy mẫu hoặc sơ xuất trong quá trình lấy mẫu.
Ngƣời phân tích có thể lấy mẫu ngồi cánh đồng hoặc lấy mẫu lơ hàng. Nếu lấy mẫu lơ hàng thì mẫu phải đại diện cho một lơ hàng. Mục đích của q trình lấy
mẫu này là kiểm tra mức dƣ lƣợng hóa chất BVTV có vƣợt q MRLs khơng. Trong quá trình lấy mẫu tránh làm nhiễm bẩn.
Mẫu lấy ngẫu nhiên ở các vị trí khác nhau. Mẫu đƣợc đựng trong túi PE sạch, mã hóa và mang về bảo quản trong tủ lạnh ở dƣới 5o
C.
2.3.2. Phƣơng pháp phân tích mẫu
(a) Lựa chọn phương pháp: Tùy theo tính chất của đối tƣợng nghiên cứu (rau, quả)
và của đối tƣợng phân tích (hóa chất BVTV) mà sử dụng phƣơng pháp xử lý mẫu thích hợp.
- Chiết, làm sạch và làm giàu đối tƣợng phân tích: + Chiết đối tƣợng phân tích bằng dung mơi hữu cơ.
+ Nếu dung mơi chiết ít hoặc khơng phân cực, làm sạch và làm giàu đối tƣợng phân tích bằng phƣơng pháp chiết pha rắn SPE sử dụng Silica hoặc Florisil.
+ Nếu dung mơi chiết phân cực hoặc trung bình, làm sạch và làm giàu đối tƣợng phân tích bằng phƣơng pháp chiết pha rắn SPE trên cột C18.
- Kỹ thuật bổ trợ làm tăng hiệu quả chiết: nhiệt độ (chiết nóng cách thủy, chiết Soxhlet); siêu âm; ly tâm; khuấy trộn siêu tốc; vi sóng hỗ trợ…
(b), Một số thực nghiệm khảo sát:
- Khảo sát lựa chọn dung môi chiết: acetonitril và aceton. Khảo sát so sánh hiệu suất chiết trên mẫu thử đƣợc thêm chuẩn.
- Khảo sát so sánh dung môi rửa giải về hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn khi qua cột là hexan : petroleum ete (1:1); acetone : petroleum ete (1:1); hexan : aceton (5:1).
- Cách tiến hành khảo sát hiệu suất thu hồi trên mẫu chuẩn khi cho qua cột: chuyển 6 ml dung dịch chuẩn có chứa các chất phân tích (pha trong nền mẫu trắng - dƣa chuột) cần khảo sát vào cột. Để dịch chảy tự nhiên, sau đó rửa giải với các dung môi cần khảo sát. Thu hồi dung môi rửa giải, chia thành 2 đến 3 phân đoạn và hứng vào các ống nghiệm khác nhau. Làm bay hơi bằng khí nitơ tới cặn. Hòa tan cắn trong 1 ml n-hexan và chạy theo chƣơng trình sắc ký đã chọn.
- Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn khi qua cột sẽ ghi đƣợc số ml dung môi rửa giải đủ để lấy hết chất phân tích và dung mơi rửa giải thích hợp.
(c), Đánh giá phương pháp chiết và làm sạch: dựa vào hiệu suất chiết (tỷ lệ)
thu hồi (%R) trên mẫu nhiễm. Mẫu nhiễm đƣợc tạo ra từ mẫu trắng bằng phƣơng pháp thêm chuẩn. Chiết và làm sạch mẫu nhiễm theo phƣơng pháp đã nêu, phân tích bằng sắc ký xác định hiệu suất thu hồi.
Phân tích sắc ký định tính và định lƣợng hóa chất BVTV
2.3.3. Quy trình phân tích mẫu
Xây dựng quy trình chiết và làm sạch hóa chất BVTV trong mẫu rau quả
2.3.3.1. Chiết mẫu [8][11][12][23][24][27][31][35][50]:
Cân 10g mẫu (m) chính xác tới 0,1mg vào ống ly tâm. Cho vào 40 ml acetone (V1), đồng nhất bằng thiết bị Ultra-Turrax với tốc độ 13500 vòng/phút trong 3 phút. Thêm lần lƣợt 20ml petroleum ether (V2), 20ml dichloromethane (V3) và cho 10g natri sulphat khan, đồng nhất 1 phút, ly tâm 30 phút ở tốc độ 5000 vòng/phút. Lƣu dịch chiết.
2.3.3.2. Làm sạch dịch chiết bằng SPE pha đảo[8][11][12][23][27][32][33][37]:
Sử dụng cột SPE C18: đổ 10 ml dung môi n-hexan cho chảy qua cột với tốc độ 1 ml/phút. Chuyển 8 ml dịch chiết (V4) trên cho vào cột đã hoạt hóa. Để dịch chảy tự nhiên, sau đó dùng 10 ml hỗn hợp dung môi n-hexan : acetone (5:1) (chia làm 2 lần) để rửa giải. Thu hồi dịch rửa giải, làm bay hơi dƣới luồng khí nitơ ở nhiệt độ 30
o
C tới cắn. Hòa tan cắn trong 1 ml n-hexan (VE) rồi đem phân tích bằng GC-MS.
2.3.3.3. Tính tốn kết quả
Dùng đƣờng chuẩn để tính nồng độ của mẫu thử khi bơm vào máy (Cm) Dƣ lƣợng từng hóa chất thuốc BVTV (C) trong mẫu đƣợc tính theo cơng thức:
P m V V V V V C kg mg C E m 4 3 2 1 ) ( ) / ( Trong đó:
VE: Thể tích cuối dung dịch mẫu thử, ml V1: Thể tích dung mơi acetone, ml
V2 : Thể tích dung mơi petroleum ether , ml V3 : Thể tích dung mơi dichloromethane, ml
V4: Thể tích pha hữu cơ đƣợc lấy ra để làm sạch, ml m : Khối lƣợng mẫu thử, g
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ T ẢO LUẬN 3.1. Tối ƣu các điều kiện xác định OPs bằng GC-MS
3.1.1. Chọn điều kiện bơm mẫu
Dựa vào các tài liệu tham khảo [38],[39],[42],[53],[58],[59] với hệ thống GC 6890 Plus ghép nối với khối phổ MS 5973N (Agilent), để phù hợp cấu hình máy và đạt đƣợc yêu cầu về độ chính xác, độ lặp lại của thiết bị, phù hợp với phân tích xác định dƣ lƣợng các hóa chất BVTV trong rau quả ở hàm lƣợng vết, chúng tơi chọn thể tích bơm mẫu là 2 µl, chọn chế độ tiêm khơng chia dịng (splitless).
Nhiệt độ cổng tiêm đƣợc lựa chọn là 250oC theo [25],[40],[41],[59] đảm bảo mẫu có thể phân hủy bởi nhiệt độ. Hơn nữa nhiệt độ buồng bơm quá cao có thể ảnh hƣởng đến độ bền của đệm cao su (septum) gây hở khí và làm ảnh hƣởng đến độ ổn định của phƣơng pháp và độ chính xác của kết quả. Dung môi sử dụng để pha các mẫu chạy sắc ký đƣợc chọn là n-hexan do nó có khả năng tăng cƣờng đƣợc hiệu quả của hiệu ứng dung mơi.
3.1.2. Chọn cột tách
Cột tách góp một phần khá quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có độ phân giải tốt hay khơng. Để chọn loại cột có pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích. Theo các tài liệu [25],[40],[41],[53],[59] với các đối tƣợng cần tách là các hóa chất BVTV nhóm phốt pho hữu cơ, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng cột Agilent DB-5ms Ultra Inert GC Column 15 mm x 0,25 mm x 0,25 µm để nghiên cứu.
3.1.3. Chọn chƣơng trình nhiệt độ của buồng cột
Chƣơng trình nhiệt độ của cột phân tích phụ thuộc vào các yếu tố sau: - Nhiệt độ giới hạn trên của cột phân tích
- Nhiệt độ sơi của cấu tử cần phân tích
- Độ phức tạp của mẫu: số lƣợng các cấu tử nhiều hay ít, nhiệt độ sơi xấp xỉ hay khác xa nhau.
Bảng 3.1. Chƣơng trình nhiệt độ cho nhóm OP TT Nhiệt độ cột GC TT Nhiệt độ cột GC
(oC)
Tốc độ tăng nhiệt độ
(oC/phút)
Thời gian duy trì
(phút)
1 70 0 2
2 150 25 0
3 250 5 5
3.1.4. Lựa chọn các thông số cho detecto khối phổ MSD 5973N
Theo các thông số cài đặt của nhà sản xuất Agilent và các tài liệu tham khảo [8],[11],[25],[38],[41],[42],[60] chúng tôi chọn các thông số nhƣ sau: nhiệt độ nguồn ion 230oC; Năng lƣợng ion hóa Ei 70 eV; Detector gain 1,2 kV; Thời gian ngắt dung môi 7 phút; Chế độ TIC: quét các ion trong khoảng m/z: 50 đến 550 amu; Chế độ SIM hoặc SCAN. Nhiệt độ kết nối (interface): 250oC (chúng tôi sẽ khảo sát ở mục 3.1.6)
3.1.5. Khảo sát tốc độ khí mang Heli
Căn cứ vào tài liệu của hãng Agilent và tài liệu tham khảo [53],[55],[60], chúng tôi đã tiến hành khảo sát tốc độ khí mang Heli (99.999%) ảnh hƣởng đến thời gian lƣu và diện tích pic ở các mức 1,0 ml/phút, 1,2 ml/phút và 1,4 ml/phút.
Các hoạt chất thuốc trừ sâu cơ phốt pho bao gồm: Thiazinon, Sulfotep, Phorate, Disulfoton, Methyl parathion và Parathion đƣợc chọn để khảo sát.
Với các điều kiện đã chọn cho thiết bị GC theo mục 3.1.1 đến 3.1.4 chúng tôi tiến hành khảo sát với dung dịch hỗn hợp chuẩn của các OP 1000ppb. Kết quả thu đƣợc nhƣ trong các hình 3.1 đến 3.5.
8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 7 0 0 0 8 0 0 0 9 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 2 0 0 0 1 3 0 0 0 1 4 0 0 0 1 5 0 0 0 1 6 0 0 0 1 7 0 0 0 1 8 0 0 0 1 9 0 0 0 2 0 0 0 0 2 1 0 0 0 2 2 0 0 0 2 3 0 0 0 2 4 0 0 0 Ti me - - > Ab u n d a n c e TI C : OPS0 7 0 9 5 . D 8 . 3 9 8 . 6 6 9 . 4 6 9 . 8 0 1 0 . 3 7 1 1 . 7 4 1 3 . 1 8 1 3 . 8 0 1 4 . 9 1 1 7 . 3 7 2 0 . 5 5
Hình 3.1. Sắc đồ hỗn hợp chuẩn OPs 1000ppb với tốc độ khí 1,0 ml/phút
8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 7 0 0 0 8 0 0 0 9 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 2 0 0 0 1 3 0 0 0 1 4 0 0 0 1 5 0 0 0 1 6 0 0 0 1 7 0 0 0 1 8 0 0 0 1 9 0 0 0 2 0 0 0 0 2 1 0 0 0 2 2 0 0 0 2 3 0 0 0 2 4 0 0 0 2 5 0 0 0 2 6 0 0 0 Ti me - - > Ab u n d a n c e TI C : OPS0 7 0 9 3 . D 8 . 0 3 9 . 0 8 9 . 4 1 9 . 9 5 1 0 . 7 3 1 1 . 3 1 1 2 . 7 3 1 3 . 3 6 1 4 . 4 4 1 5 . 8 5 1 6 . 9 1 1 8 . 2 5 2 0 . 0 5 2 0 . 5 1 2 2 . 6 6 2 4 . 7 0 2 5 . 0 2
Hình 3.2. Sắc đồ hỗn hợp chuẩn OPs 1000ppb với tốc độ khí 1,2 ml/phút
8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 2 2 0 0 0 2 4 0 0 0 Ti me - - > Ab u n d a n c e TI C : OPS0 8 0 9 2 . D 7 . 7 3 8 . 7 6 9 . 0 7 9 . 6 0 1 0 . 9 4 1 2 . 3 4 1 2 . 9 8 1 4 . 0 4 1 6 . 5 1 1 9 . 6 1 3 0 . 8 5
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của tốc độ khí mang Heli đến đến diện tích pic
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của tốc độ khí mang Heli đến thời gian lƣu
Từ hình 3.4 và hình 3.5, chúng tơi thấy khi tốc độ khí mang Heli tăng lên thì thời gian lƣu giảm, các pic vẫn tách rời khỏi nhau một cách rõ ràng, diện tích pic của các chất tăng không đáng kể. Chúng tơi thấy rằng khi tăng tốc độ khí mang thì tùy đối với từng chất có ảnh hƣởng khác nhau.
Để đảm bảo cho các chất đƣợc tách hồn tồn khỏi nhau và tính hiệu quả kinh tế chúng tôi đã chọn tốc độ của dịng khí mang Heli là 1,2ml/phút (hình 3.2) cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.6. Khảo sát nhiệt độ bộ phận kết nối (Interface)
Căn cứ vào tài liệu của hãng và tài liệu tham khảo [53],[55],[60], chúng tôi đã tiến hành khảo sát nhiệt độ của bộ phận kết nối GC-MS ở các mức 230oC, 250oC và 280oC với các điều kiện đã chọn cho thiết bị GC/MS theo mục 3.1.1 đến 3.1.5. Nồng độ dung dịch hỗn hợp chuẩn của các OP 1000ppb.
Các hoạt chất thuốc trừ sâu cơ phốt pho bao gồm: Thiazinon, Sulfotep, Phorate, Disulfoton, Methyl parathion và Parathion đƣợc chọn để khảo sát.
8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 2 2 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : O P S 0 8 0 9 3 . D 8 . 3 9 9 . 4 6 9 . 8 0 1 0 . 3 6 1 1 . 1 4 1 1 . 7 4 1 3 . 1 8 1 3 . 4 2 1 3 . 8 0 1 4 . 9 1 1 7 . 3 7 2 0 . 5 4
Hình 3.6. Sắc đồ hỗn hợp chuẩn OPs 1000ppb với nhiệt độ kết nối 230oC
8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 1 4 0 0 0 1 6 0 0 0 1 8 0 0 0 2 0 0 0 0 2 2 0 0 0 2 4 0 0 0 2 6 0 0 0 T i m e - - > A b u n d a n c e T I C : O P S 0 8 0 9 5 . D 8 . 3 9 9 . 4 6 9 . 8 0 1 0 . 3 7 1 1 . 7 5 1 3 . 1 9 1 3 . 4 3 1 3 . 8 1 1 4 . 9 1 1 7 . 3 8 2 0 . 5 5 3 0 . 8 6
Hình 3.8. Sắc đồ hỗn hợp chuẩn OPs 1000ppb với nhiệt độ kết nối 280oC
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ kết nối GC-MS đến thời gian lƣu
Từ hình 3.9 chúng tơi thấy rằng nhiệt độ bộ phận kết nối tại 250 oC thì thời gian lƣu giảm và các píc vẫn tách khỏi nhau một cách rõ ràng. Còn tại nhiệt độ 230oC và 280 oC thì thời gian lƣu lớn hơn. Do đó để giảm thời gian cho q trình phân tích chúng tơi chọn nhiệt độ của bộ phận kết nối là 250 oC cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.2a. Các thơng số tối ƣu cho q trình chạy sắc ký
TT Thông số Chỉ tiêu GC/MS
1 Nhiệt độ nguồn ion hóa 230 oC 2 Nhiệt độ bộ phận ghép nối
(interface) 250
oC
3 Nhiệt độ detecto 200 oC 4 Nhiệt độ cổng bơm mẫu 250 oC 5 Thể tích bơm mẫu 2 µl 6 Chế độ bơm mẫu khơng chia dịng 7 Khí mang Heli (99,999)
8 Cột tách DB-5MS
15m x 0,25mm x 0,25µm 9 Tốc độ dịng khí mang qua cột tách 1,2 ml/phút
10 Chế độ chạy GC SIM và SCAN 11 Điện thế detector 1,0 kV 12 Áp suất đầu cột 71 kPa
13 Hệ bơm mẫu Tự động hoặc bằng tay
Bảng 3.2b. Chƣơng trình nhiệt độ cho nhóm OP TT Nhiệt độ cột GC
(oC)
Tốc độ tăng nhiệt độ
(oC/phút)
Thời gian duy trì
(phút)
1 70 0 2
2 150 25 0
3 250 5 5
3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn 3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ của các hợp chất cơ phốt pho để tìm giới hạn tuyến tính và lập đƣờng chuẩn. Từ dung dịch chuẩn gốc pha một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 50 ppb đến 1500 ppb từ dung dịch chuẩn gốc 100 ppm và chuẩn trung gian 10 ppm. Các dung dịch chuẩn đƣợc pha trong n-hexan.
Tiến hành bơm dung dịch hỗn hợp chuẩn OP vào hệ thống GC-MS theo các điều kiện đã tối ƣu theo mục 3.1 (bảng 3.2a). Tại mỗi nồng độ lặp lại 3 lần, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ OPs
Nồng độ (ppb)
Diện tích pic
Thionazin Sulfotep Phorate Disulfoton Methyl
parathion Parathion Hexan - - - - - - Hexan - - - - - - 50 30742 36528 49817 40388 16061 24718 100 75072 85615 120343 75032 31823 38508 500 1004599 1335321 1315214 1309321 388318 468227 1000 2255328 2494752 3431041 2319532 1122661 1184222 1500 2559897 3772184 4217993 3807639 1686560 1876020
Bảng 3.4. Thời gian lƣu của các chất phân tích nhóm phốt pho hữu cơ Chất phân tích Chất phân tích
Thionazin Sulfotep Phorate Disulfoton Methyl
parathion Parathion Thời gian lƣu tR (phút) 8,02 9,08 9,39 11,30 12,71 14,42 8 . 0 0 9 . 0 0 1 0 . 0 0 1 1 . 0 0 1 2 . 0 0 1 3 . 0 0 1 4 . 0 01 5 . 0 0 1 6 . 0 0 1 7 . 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0 4 5 0 0 5 0 0 0 5 5 0 0 6 0 0 0 6 5 0 0 7 0 0 0 7 5 0 0 Ti m e - - > A b u n d a n c e T I C : OP 2 1 1 0 6 . D 8 . 0 2 9 . 0 7 9 . 3 8 1 1 . 3 0 1 2 . 7 3 1 4 . 4 3 Hình 3.10. Sắc đồ hỗn hợp chuẩn OP 50 ppb
8 . 0 0 9 . 0 0 1 0 . 0 0 1 1 . 0 0 1 2 . 0 0 1 3 . 0 0 1 4 . 0 0 1 5 . 0 0 1 6 . 0 0 1 7 . 0 0