Chú thích: 1. Marker 100 bp (Thermo Fisher, USA), 2. Đối chứng âm (nước thay cho DNA), 3-4. Mẫu dương tính với BKV.
Từ kết quảđiện di cho thấy, băngđặc hiệu có kích thước là 580 bp, đậm nét và khơng có sản phẩm phụ (giếng 3-4). Đối chứng âm không lên băng (giếng 2) chứng tỏ thao tác kỹ thuật tốt, đáng tin cậy. Trong nghiên cứu này, Phusion Hight- Fidelity PCR master mix 2X được sử dụng gồm hỗn hợp chứa Phusion DNA Polymerase, các nucleotide, buffer và MgCl2. Phusion DNA polymerase có hai hoạt tính: 5’-3’ DNA polymerase và 3’-5’ exonuclease. Tỷ lệ lỗi của Phusion DNA
polymerase trong buffer HF là 4,4 x10-7, thấp hơn 50 lần so với Taq DNA polymerase, thấp hơn 6 lần so với Pfu DNA polymerase. Phusion DNA polymerase đạt được hiệu suất cao trong thời gian ngắn ngay cả khi có mặt của các chất ức chế phản ứng PCR, do đó tạo ra năng suất cao hơn với lượng enzyme thấp hơn các DNA polymerase khác. Như vậy, Phusion DNA polymerase là sự lựa chọn tốt nhất cho tách dịng.
Chu trình nhiệt phản ứng PCR với sự có mặt của Phusion DNA polymerase có nhiều khác biệt so với các điều kiện chuẩn của DNA polymerase khác. Nhiệt độ biến tính là 98oC (cao hơn nhiệt độ biến tính của enzyme thơng thường là 95oC), cho phép cải thiện khảnăng phân tách DNA ngay cả với khuôn dài và giàu GC, thời gian ngắn (biến tính (5 giây- 10 giây); kéo dài (15 giây- 30 giây); gắn mồi (10 giây- 30 giây)) giúp tiết kiệm thời gian nhưng hiệu quả PCR vẫn không thay đổi.
• Biến nạp
Sau khi biến nạp, tế bào E. coli DH5α được nuôi lỏng trên môi trường dinh dưỡng (SOC) trong 2 giờ 30 phút, lắc 225 vòng/phút, 37oC và được cấy trải trên mơi trường LB-ampicilin (50 µg/µl)/IPTG/Xgal. Sau 24 giờ, xuất hiện các khuẩn lạc trắng (chứa plamid tái tổ hợp) và khuẩn lạc xanh (chỉ chứa plasmid) trên đĩa thạch (Hình 3.2).