Sau khi xây dựng đường cong tuyến tính và phân tích cho thấy sự tương quan tuyến tính mạnh giữa bộ mẫu chuẩn WHO và bộ mẫu chuẩn nghiên cứu
y = 0.9915x - 0.9612 R² = 0.9963 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 0 1 2 3 4 5 6 W HO ( IU /µ l) LDA (copy/µl)
(R2=0,9963, p<0,0001). Từ phương trình tương quan Log10 (IU/µl) = 0,9915 Log10 (IU/µl) – 0,9612 xác định được 1IU= 9,6 copy. Bộ mẫu chuẩn quốc tếđầu tiên của WHO được giới thiệu vào năm 2016 với vai trò là một bộ mẫu hiệu chuẩn chung nhằm cải thiện và thống nhất chung các xét nghiệm khuếch đại acid nucleic BKV (NAT) cũng như cho phép so sánh các phép đo sinh học trên toàn thế giới. Tương tự như các bộ mẫu chuẩn được phát hành trước đây đối với cytomegalovirus (CMV) và virus Epstein-Barr (EBV), bộ mẫu chuẩn quốc tế đầu tiên của WHO về BKV là một tài liệu tham khảo định lượng được thể hiện trong một đơn vị quốc tế (IU). Cho đến nay, vẫn chưa có nhiều các nghiên cứu hiệu chuẩn các xét nghiệm tự phát triển của các phòng nghiên cứu (in-house laboratory-developed assays) trên đối tượng BKV mà chỉ có những thí nghiệm đánh giá những bộkit thương mại trên thị trường như Altona RealStar BKV PCR kit (Hamburg, Germany), AcroMetrix (BKVtc panel; AcroMetrix Inc., Benicia, CA), ZeptoMetrix (NATtrol bkvirus linearity panel; ZeptoMetrix Corporation, Buffalo, NY). Nghiên cứu của Susanna K. Tan và cộng sự(2017) đối với bộ kit Altona RealStar BKV PCR (Hamburg, Germany) cho kết quả là 1 IU = 1,11 copy [81], trong khi đối với ZeptoMetrix thì 1 IU= 0,7 copy, AcroMetrix 1 IU= 0,76 copy [11]. Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng các mẫu chuẩn tự phát triển không phải lúc nào cũng chứa số lượng bản sao bằng nhau của trình tựđích, và một trong số những ngun nhân dẫn tới sự sai khác có thể do việc lựa chọn vị trí đích hoặc nồng độ plasmid thu được cao hơn so với thực tế do còn lẫn DNA của vi khuẩn E. coli. Chính vì thế, một đơn vị chuẩn quốc tếcho xác định nồng độ BKV-DNA trên mẫu lâm sàng là cần thiết để hỗ trợ cho sinh thiết thận trong chẩn đoán BKVN trong thực hành lâm sàng.
Định lượng BKV được khuyến cáo trong các hướng dẫn cho các chỉ định khác nhau, bao gồm sàng lọc sau ghép thường quy để xác định bệnh nhân có nguy cơ cao mắc BKVN (trường hợp cần giảm liều thuốc ức chế miễn dịch), do đó xác định tải lượng BKV-DNA là một biện pháp bổ trợ cho sinh thiết thận nhằm chẩn đoán bệnh thận cũng như theo dõi quá trình diễn biến lâm sàng của bệnh thận đã có sự hình thành BKV. Sự sai khác trong định lượng BKV khi chưa hiệu chuẩn với
mẫu chuẩn của WHO có thể dẫn đến việc ra quyết định can thiệp điều trị khơng phù hợp. Nếu khơng chẩn đốn kịp thời, khả năng tái kích hoạt sớm BKV trong quá trình sàng lọc do kết quả xét nghiệm âm tính giả trong việc xác định tải lượng BKV, làm tăng nguy cơ bỏ qua các trường hợp có khả năng bị BKVN. Ngược lại, việc đánh giá quá cao tải lượng BKV có thể dẫn đến chỉ định sinh thiết thận không cần thiết hoặc giảm liều thuốc ức chế miễn dịch không phù hợp. Việc hiệu chuẩn các xét nghiệm BKV NAT theo đơn vị quốc tế ngày càng được áp dụng trong các phịng thí nghiệm vi sinh lâm sàng trên toàn thế giới và là một bước cần thiết để xác định giá trị cut off BKV-DNA phù hợp trong định lượng, áp dụng rộng rãi cho thực hành lâm sàng. Việc công bố mẫu chuẩn quốc tếđầu tiên của WHO về BKV-DNA mang đến tiềm năng cải thiện khảnăng so sánh giữa các bộ kit xét nghiệm và thiết lập ngưỡng tải lượng BK virus cho chẩn đoán sớm BKVN. Sự thống nhất một đơn vị chung mở ra những cơ hội mới để chuẩn hóa phịng ngừa sự xuất hiện BKVN tiên phát và thứ phát, theo dõi và đánh giá các phương pháp trị liệu mới và các chiến lược trị liệu ở bệnh nhân nhiễm BKV.
• Khảo sát khoảng định lượng và xác định ngưỡng phát hiện
Trước tiên, nồng độ ngưỡng dưới và ngưỡng trên của bộ mẫu chuẩn được khảo sát để xác định giới hạn định lượng của bộ mẫu chuẩn. Kết quả xác định khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn từ 10-1-107 (IU/µl) được thể hiện ở hình 3.9.