STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl)
1 Quantitect Probe master mix 1X 10
2 Primer (F+R) 5 µM 0,2 µM 0,8
3 Probe 5 µM 0,05 µM 0,2
4 Nước đã khử ion DNA/RNAase free 0
5 DNA template 9
Tổng 20
Chu trình nhiệt được xác định như sau:
(50oC x 2 phút) (95oC x 15phút) (94oC x 15 giây, 58oC x 60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7o
C.
2X Quantitect probe PCR Mastermix là hỗn hợp bao gồm HotStarTaq DNA Polymerase, QuantiTect Probe PCR Buffer và ROX passive reference dye. HotstarTaq DNA polymerase là một enzyme Taq DNA polymerase cải tiến, được cung cấp ở trạng thái enzyme không hoạt động trong điều kiện nhiệt độ môi trường. Khả năng tái hoạt động được kích hoạt khi bắt đầu phản ứng bằng bước ủ 95°C- 15 phút, qua đó ngăn chặn sự hình thành các sản phẩm ngoại lai và sự bắt cặp ngẫu nhiên giữa các mồi trong quá trình thiết lập phản ứng và bước biến tính đầu tiên, tăng khả năng đặc hiệu cho phản ứng PCR cũng như định lượng chính xác. Trong khi đó, QuantiTect Probe PCR Buffer chứa sự kết hợp cân bằng giữa KCl và (NH4)2SO4, giúp tăng khả năng cạnh tranh giữa sản phẩm đặc hiệu với liên kết mồi không đặc
hiệu trong bước ủ của mỗi chu kỳ PCR. Ngoài ra, với sự thay thế dTTP thành dUTP cộng thêm bổ sung uracil-N-glycosylase (UNG) cho phản ứng giúp đề phòng ngoại nhiễm với các sản phẩm PCR từ những lần chạy trước. Mặt khác, sự có mặt của thuốc nhuộm ROX cung cấp một đường cơ sở ổn định để tín hiệu huỳnh quang của PCR được chuẩn hóa. Như vậy, tất các các thành phần của phản ứng real-time PCR đã được tối ưu hóa nhằm đạt được hiệu suất khuếch đại tốt nhất.
3.1.5. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR
• Đánh giá độđặc hiệu
Độ đặc hiệu trong định lượng BKV bằng kỹ thuật real-time PCR được thể hiện qua khả năng nhân bản chọn lọc BKV. Trong nghiên cứu này, độ đặc hiệu được thử nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm nhiễm JCV (10 mẫu), CMV (5 mẫu), EBV (5 mẫu), HBV (5 mẫu), HSV (5 mẫu) và 30 mẫu máu của bệnh nhân khỏe mạnh. Kết quảđánh giá được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3. 2. Đánh giá độđặc hiệu Mẫu Realtime-PCR JCV (-) CMV (-) EBV (-) HSV (-) Khỏe mạnh (-)
Sau khi đánh giá trên các mẫu bệnh phẩm nhiễm virus khác nhận thấy các cặp mồi và probe chỉ đặc hiệu với BKV-DNA (Bảng 3.2). Như vậy, bộ kit nghiên cứu chỉ nhân bản vật liệu di truyền BKV-DNA mà không nhân bản chọn lọc vật liệu di truyền của các tác nhân khác.
Những nghiên cứu trước đây cho thấy sự xuất hiện của JCV, CMV, HSV, EBV ở bệnh nhân ghép tạng khác với tỷ lệkhá cao, làm tăng nguy cơ mắc bệnh và tử vong. Sự tái hoạt động kết hợp của các virus này đã được quan sát nhiều lần ở
những bệnh nhân sau ghép tạng trong đó JCV là virus cùng họ với BKV cũng được chỉ ra xuất hiện trong nước tiểu của bệnh nhân ghép thận với tỷ lệ từ 16-28% [17]. Tỷ lệ lưu hành của CMV ở những bệnh nhân ghép tim dao động từ 9-23%, bệnh nhân ghép gan 22%-29%, đặc biệt ở những bệnh nhân sau ghép thận từ 8-32% [5] và sự tái kích hoạt CMV thường liên quan tới viêm võng mạc, viêm phổi, viêm đại tràng, viêm não, đặc biệt gây tổn thương thận ghép, mất ghép và tử vong. Bên cạnh đó, EBV sau ghép thận chủ yếu liên quan đến rối loạn tăng sinh tế bào lympho sau ghép, một biến chứng nặng nề trong ghép tạng, chủ yếu ở những bệnh nhân sau năm đầu tiên, với các triệu chứng bao gồm những rối loạn từ thoái triển tựphát đến tăng sinh tế bào B gây tử vong [14]. Trong khi đó, HBV là virus lây lan chủ yếu thông qua đường máu và chiếm tỷ lệlưu hành khá lớn trong cộng đồng dân cư Việt Nam. Do đó, những virus này được chọn đểđánh giá độđặc hiệu.
• Hiệu chỉnh nồng độ mẫu chuẩn theo bộ mẫu chuẩn của WHO
Kết quả phân tích mối tương quan giữa bộ mẫu chuẩn WHO và bộ mẫu chuẩn nghiên cứu (LDA) được thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3. 8. So sánh sựtương quan giữa bộ mẫu chuẩn WHO và LDA
Sau khi xây dựng đường cong tuyến tính và phân tích cho thấy sự tương quan tuyến tính mạnh giữa bộ mẫu chuẩn WHO và bộ mẫu chuẩn nghiên cứu
y = 0.9915x - 0.9612 R² = 0.9963 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 0 1 2 3 4 5 6 W HO ( IU /µ l) LDA (copy/µl)
(R2=0,9963, p<0,0001). Từ phương trình tương quan Log10 (IU/µl) = 0,9915 Log10 (IU/µl) – 0,9612 xác định được 1IU= 9,6 copy. Bộ mẫu chuẩn quốc tếđầu tiên của WHO được giới thiệu vào năm 2016 với vai trò là một bộ mẫu hiệu chuẩn chung nhằm cải thiện và thống nhất chung các xét nghiệm khuếch đại acid nucleic BKV (NAT) cũng như cho phép so sánh các phép đo sinh học trên toàn thế giới. Tương tự như các bộ mẫu chuẩn được phát hành trước đây đối với cytomegalovirus (CMV) và virus Epstein-Barr (EBV), bộ mẫu chuẩn quốc tế đầu tiên của WHO về BKV là một tài liệu tham khảo định lượng được thể hiện trong một đơn vị quốc tế (IU). Cho đến nay, vẫn chưa có nhiều các nghiên cứu hiệu chuẩn các xét nghiệm tự phát triển của các phòng nghiên cứu (in-house laboratory-developed assays) trên đối tượng BKV mà chỉ có những thí nghiệm đánh giá những bộkit thương mại trên thị trường như Altona RealStar BKV PCR kit (Hamburg, Germany), AcroMetrix (BKVtc panel; AcroMetrix Inc., Benicia, CA), ZeptoMetrix (NATtrol bkvirus linearity panel; ZeptoMetrix Corporation, Buffalo, NY). Nghiên cứu của Susanna K. Tan và cộng sự(2017) đối với bộ kit Altona RealStar BKV PCR (Hamburg, Germany) cho kết quả là 1 IU = 1,11 copy [81], trong khi đối với ZeptoMetrix thì 1 IU= 0,7 copy, AcroMetrix 1 IU= 0,76 copy [11]. Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng các mẫu chuẩn tự phát triển không phải lúc nào cũng chứa số lượng bản sao bằng nhau của trình tựđích, và một trong số những nguyên nhân dẫn tới sự sai khác có thể do việc lựa chọn vị trí đích hoặc nồng độ plasmid thu được cao hơn so với thực tế do còn lẫn DNA của vi khuẩn E. coli. Chính vì thế, một đơn vị chuẩn quốc tếcho xác định nồng độ BKV-DNA trên mẫu lâm sàng là cần thiết để hỗ trợ cho sinh thiết thận trong chẩn đoán BKVN trong thực hành lâm sàng.
Định lượng BKV được khuyến cáo trong các hướng dẫn cho các chỉ định khác nhau, bao gồm sàng lọc sau ghép thường quy để xác định bệnh nhân có nguy cơ cao mắc BKVN (trường hợp cần giảm liều thuốc ức chế miễn dịch), do đó xác định tải lượng BKV-DNA là một biện pháp bổ trợ cho sinh thiết thận nhằm chẩn đoán bệnh thận cũng như theo dõi quá trình diễn biến lâm sàng của bệnh thận đã có sự hình thành BKV. Sự sai khác trong định lượng BKV khi chưa hiệu chuẩn với
mẫu chuẩn của WHO có thể dẫn đến việc ra quyết định can thiệp điều trị không phù hợp. Nếu khơng chẩn đốn kịp thời, khả năng tái kích hoạt sớm BKV trong q trình sàng lọc do kết quả xét nghiệm âm tính giả trong việc xác định tải lượng BKV, làm tăng nguy cơ bỏ qua các trường hợp có khả năng bị BKVN. Ngược lại, việc đánh giá quá cao tải lượng BKV có thể dẫn đến chỉ định sinh thiết thận không cần thiết hoặc giảm liều thuốc ức chế miễn dịch không phù hợp. Việc hiệu chuẩn các xét nghiệm BKV NAT theo đơn vị quốc tế ngày càng được áp dụng trong các phịng thí nghiệm vi sinh lâm sàng trên tồn thế giới và là một bước cần thiết để xác định giá trị cut off BKV-DNA phù hợp trong định lượng, áp dụng rộng rãi cho thực hành lâm sàng. Việc công bố mẫu chuẩn quốc tếđầu tiên của WHO về BKV-DNA mang đến tiềm năng cải thiện khảnăng so sánh giữa các bộ kit xét nghiệm và thiết lập ngưỡng tải lượng BK virus cho chẩn đoán sớm BKVN. Sự thống nhất một đơn vị chung mở ra những cơ hội mới để chuẩn hóa phịng ngừa sự xuất hiện BKVN tiên phát và thứ phát, theo dõi và đánh giá các phương pháp trị liệu mới và các chiến lược trị liệu ở bệnh nhân nhiễm BKV.
• Khảo sát khoảng định lượng và xác định ngưỡng phát hiện
Trước tiên, nồng độ ngưỡng dưới và ngưỡng trên của bộ mẫu chuẩn được khảo sát để xác định giới hạn định lượng của bộ mẫu chuẩn. Kết quả xác định khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn từ 10-1-107 (IU/µl) được thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3. 9. Xác định khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn
A, Biểu đồ đường cong khuếch đại tín hiệu huỳnh quang B, Đường chuẩn xây dựng từ dải nồng độ 10-1-107 (IU/µl)
Hiệu suất phản ứng PCR là 90% cho thấy quy trình tối ưu phản ứng real-time PCR cũng như các thao tác kỹ thuật tốt. Kết quả khảo sát khoảng định lượng cho thấy các nồng độ trong khoảng này có độ tuyến tính cao, thể hiện qua hệ số tuyến tính bằng 0,99 (Hình 3.9). Do đó, khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn từ 10-1-107 (IU/µl) là chính xác và đáng tin cậy.
Mẫu huyết tương với nồng độ 106 IU/ml (xác định bằng bộ mẫu chuẩn của WHO) được hịa lỗng thành các dải nồng độ khác nhau. Kết quảphân tích ngưỡng phát hiện được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.10.
Bảng 3. 3. Khảo sát độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu bệnh phẩm Nồng độ (IU/ml) Số lần chạy Số lần phát hiện Tần số phát hiện Nồng độ (IU/ml) Số lần chạy Số lần phát hiện Tần số phát hiện 900 12 12 100% 600 12 12 100% 300 12 12 100% 150 12 12 100% 50 12 8 66,67% 25 12 4 33,33%
Hình 3. 10. Ngưỡng phát hiện BKV-DNA trên mẫu bệnh phẩm
Xác định độ nhạy thơng qua phân tích thống kê probit sử dụng phần mềm Quodata cho thấy, ngưỡng phát hiện BKV-DNA của kỹ thuật real-time PCR là LOD95% =135 IU/ml, tương đương [84,34 - 215,88 IU/ml] với độ tin cậy 95% (Hình 3.10). Trong khi đó, nghiên cứu của Susanna K. Tan và cộng sự (2017) [81], đối với bộ kit Altona RealStar BKV PCR kit (Hamburg, Đức) xác định giá trị ngưỡng là 66 IU/ml. Như vậy, bộ kit nghiên cứu LDA có độ nhạy tương đương so với bộ kit thương mại, trong khi giá thành cạnh tranh hơn, giảm thiểu chi phí đáng kể cho người bệnh.
• Đánh giá độổn định
Từ kết quả đánh giá panel mẫu chuẩn cũng như xác định ngưỡng phát hiện trên mẫu bệnh phẩm, ba mẫu chuẩn có nồng độ 101-103 IU/µl được lựa chọn làm đường chuẩn trong xét nghiệm lâm sàng. Đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn trong thời gian 7 tháng, thu được kết quảnhư bảng 3.4.
Bảng 3. 4. Đánh giá độổn định của mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl
Nồng độ (IU/µl) Ct mean SD CV (%)
103 21,43 0,43 2,02
102 24,60 0,26 1,08
101 27,99 0,17 0,59
Chú thích: Ct mean: chu kỳ ngưỡng trung bình sau 7 tháng, SD: độ lệch chuẩn, CV: hệ số biến thiên.
Các mẫu chuẩn có hệ số biến thiên (CV%) thấp lần lượt là 2,02%; 1,08%; 0,59% cho thấy mẫu chuẩn có độổn định cao.
• So sánh với kit thương mại Realstar BKV PCR Kit
Bộ kit nghiên cứu được so sánh với bộ kit thương mại RealStar BKV PCR Kit dựa trên kết quả định lượng BKV của 30 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ghép thận tại Bệnh viện Quân y 103. Kết quả định lượng giữa hai bộ kit được so sánh bằng phương pháp hồi quy tuyến tính (Hình 3.11) và bằng biểu đồ Bland-Altman (Hình 3.12).
Hình 3. 11. So sánh sựtương quan giữa hai bộ kit
y = 1,0751x - 0,0218 R² = 0,9442 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 K it ng hi ên cứ u (L D A ) L og 1 0 I U /ml
Kit thương mại (RealStar)
Hình 3. 12. Phân tích sự khác biệt giữa hai bộ kit
Kết quảđịnh lượng giữa hai bộ kit cho thấy 26/30 mẫu dương tính với cả hai bộ kit, 4/30 mẫu âm tính với cả hai bộ kit. Kết quảđịnh lượng trên 25 mẫu dương tính với cả hai bộ kit được so sánh bằng phương pháp hồi quy tuyến tính (Hình 3.11) và bằng biểu đồ Bland-Altman (Hình 3.12). Hệ số tuyến tính là 0,94 chứng tỏ độ tương quan cao trong định lượng giữa hai bộ kit. Hệ số dốc của phương trình tuyến tính là 1,07, rất gần với giá trị 1 cho thấy khơng có sự sai lệch tỷ lệ nào. Hệ số chắn là -0,02 hơi xa với giá trị 0, chỉ ra một sự sai lệch trong hệ thống bất biến. Tuy nhiên khi phân tích bằng Bland-Altman, sựsai khác này khơng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% cho phép sai số trong khoảng (-1,3; 0,69). Do đó, hai bộ kit có độtương quan cao trong định lượng BKV.
Như vậy, bộ kit nghiên cứu đã đáp ứng được những yêu cầu về chất lượng sinh phẩm như: khoảng định lượng rộng 10-1-107 (IU/µl), độổn định cao (hệ số biến thiên là 2,02%; 1,08% và 0,59%), chất lượng bộ sinh phẩm tương đương với bộ kit ngoại nhập RealStar BKV PCR Kit. Với những kết quả quan sát ở trên, bộ kit nghiên cứu có thể thay thế bộ kit ngoại nhập mà khơng bị mất đi tính hiệu quả và chính xác. -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 0 2 4 6 8 10 12 Sự k hác b iệ t ( Log 11 0 I U /m l) Nồng độ (Log10 IU/ml)
3.1.6. Quy trình xác định tải lượng virus BK trong máu và nước tiểu ở bệnh nhân ghép thận ghép thận
Mẫu máu và nước tiểu sau khi thu thập, được vận chuyển tới phòng xét nghiệm và xửlý như sau:
B1: Mẫu máu ly tâm 3000 rpm, 1 phút, thu huyết tương. Mẫu nước tiểu ly tâm 3200 rpm, 1 phút, thu cặn nước tiểu. Mẫu máu và nước tiểu được bảo quản - 20oC cho tới khi tiến hành tách chiết DNA.
B2: Tiến hành tách chiết DNA theo quy trình hướng dẫn của bộ kit Geneall B3: Sau khi rã đông các thành phần trên đá, tiến hành vortex, spin trong 5s và mix các thành phần phản ứng realtime PCR tối ưunhư bảng sau:
STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl) (n=1) Thể tích (µl) (n mẫu)
1 Quantitect Probe master mix 1X 10 10 x n
2 Primer (F+R) 5 µM 0,2 µM 0,8 0,8 x n
3 Probe 5 µM 0,05 µM 0,2 0,2 x n
4 DNA template 9
Tổng 20
B4: Tiến hành chạy mẫu trên máy realtime PCR với chu trình nhiệt như sau (50oC 2’) (95oC 15’) (94oC 15’’ 58oC 60’’)x45
B5: Phân tích kết quảrealtime PCR như sau
• Phân tích Standard:
- Hệ số tuyến tính (R2) phải nằm trong khoảng 0.960-1.000, tốt nhất 0.990- 1.000.
- Hiệu suất nhân bản (PCR efficiency) phải nằm trong khoảng 90-115%, tốt nhất 95-110%.
- Hệ số dốc (Slope) phải nằm trong khoảng -3 đến -4, tốt nhất -3.3 đến -3.6. • Phân tích mẫu: Các trường hợp Nồng độ (IU/ml) Nhận định kết quả 1 ≤ 135 Dưới giới hạn phát hiện hoặc âm tính 2 >135 Mẫu dương tính với nồng độ a IU/ml
3.2. Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận do BKV
3.2.1. Xác định tỷ lệ lưu hành BKV ở bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR
Mẫu bệnh phẩm gồm máu và nước tiểu thu thập tại cùng một thời điểm từ 131 bệnh nhân ghép thận được sàng lọc bằng kỹ thuật real-time PCR đểxác định tỷ lệlưu hành BKV. Kết quảđược thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3. 5. Tỷ lệ nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận
Thơng số Dương tính Âm tính
Huyết tương 53 (40,46%) 78 (59,54%)
Nước tiểu 84 (64,12%) 47 (35,88%)
Cả huyết tương và nước tiểu 53 (40,46%) 47 (35,88%) Huyết tương hoặc nước tiểu 84 (64,12%) 47 (35,88%)
Tổng số 131 bệnh nhân được đưa vào nghiên cứu với tỷ lệ BKV dương tính bằng kỹ thuật real-time PCR là 64,12% (Bảng 3.5). Trong 84 bệnh nhân dương tính với BKV-DNA trong huyết tương hoặc nước tiểu, 53 bệnh nhân (40,46%) dương tính trong huyết tương, 84 bệnh nhân (64,12%) dương tính trong nước tiểu, 53 bệnh nhân (40,46%) dương tính cả trong huyết tương và nước tiểu. Một nghiên cứu khác của Yoon.S.H và cộng sự (2015) [91] trên 213 bệnh nhân ghép thận tại Hàn Quốc cho thấy tỷ lệ nhiễm BKV trong máu rất cao (142/213 trường hợp, tương ứng với 66,67%). Nghiên cứu gần đây tại Thái Lan vào năm 2018 được thực hiện bởi P. Skulratanasak và cộng sự [78], trên 173 bệnh nhân ghép thận đã phát hiện 53 bệnh