TT Pha tĩnh Thành phần pha động Tốc độ pha
động Các dạng Asen đƣợc xác định Tài liệu tham khảo 1 Bio-Rad C, (250 x 4.6 mm id, 5 m particles) 10mM C16H36N+, 20mM NaH2PO4.H2O,pH = 6 1,0 ml/phút
AsB, As(III), DMA,
MMA, As(V) [77]
2 Waters IC PAK HS (75 x 4.6
mm id, 6 µm particles) 10mM NaHCO3; pH = 9,25 1,0 ml/phút
AsB, As(III), DMA,
MMA, As(V) [4]
3 Supelcosil LC-SAX (250 x 4.6
mm id, 5 µm particles) 30mM NaH2PO4; pH = 4,5 1,0 ml/phút
AsB, AsC, As(III), DMA,
MMA, As(V) [78]
4 Shodex Asahipak ES-502N 7C,
100mm x 7.6mm i.d) 15mM C6H8O7.H2O; pH = 2 1,0 ml/phút
AsB, As(III), DMA,
MMA, As(V) [77]
5 IonPac AS22, 250 x 4.0mm i.d, Dionex, USA
2mM TBHA, 10mM
(NH4)2CO3; pH = 8 1,5 ml/phút
As(III), DMA, MMA,
As(V) [78]
6 Rspak NN-614, 150 x 6.0mm
i.d, Showa Denko, Japan
2mM TBHA, 10mM
(NH4)2CO3; pH = 8 1,5 ml/phút
As(III), DMA, MMA,
As(V) [78]
7 Hamilton PRP-X100, 250 x
4.1mm i.d, 12-20m 20mM (NH3%MeOH; pH = 7 4)2HPO4, 1,0 ml/phút
AsB, As(III), DMA,
MMA, As(V) [4]
8 Hamilton PRP-X100, 250 x
4.6mm i.d, 10m
10mM, 50mM (NH4)2CO3;
pH = 9 1,0 ml/phút
AsB, As(III), DMA,
MMA, As(V) [4, 78]
9 Dionex Ionpac C-10, 250 x 4
i.d, 10m
6-20mM pyridine,
pH = 2,7 1,0 ml/phút
AsB, As(III), DMA,
Kết luận chƣơng 1
Asen là ngun tố có độc tính cao, cần được kiểm soát hàm lượng trong các loại thực phẩm, nước uống và môi trường; dạng asen vô cơ nguy hiểm với sức khỏe con người hơn so với dạng asen hữu cơ. Thành phần asen khá cao trong một số nguồn thực phẩm, cao nhất là ở cá, nhưng chủ yếu là asen hữu cơ, hàm lượng asen vô cơ thấp. Trong các mẫu như rong biển, tôm, trai, mực chủ yếu là AsB và ít độc.
Việc lựa chọn phương pháp xác định các dạng tồn tại của As trong các đối tượng thực phẩm thông qua bộ ghép nối HPLC-ICP-MS là một phương pháp phân tích cịn mới tại Việt Nam và là một phương pháp phân tích hiện đại, cho phép xác định đồng thời các dạng asen trong mẫu, phương pháp này có độ nhạy cao, độ lặp tốt và cho kết quả ổn định.
Bên cạch đó phương pháp phân tích cũng có hạn chế:
Thiết bị ghép nối đồng bộ HPLC-ICP- MS có giá thành rất cao, lên việc trang bị thiết bị ghép nối đồng bộ ở Việt nam là rất ít. Tuy nhiên hệ thống riêng rẽ ICP-MS và HPLC thì ở nhiều phịng thí nghiệm có. Việc ghép nối 2 thiết bị không đồng bộ với nhau là những cải tiến sáng tạo, bước đầu đáp ứng được các vấn đề tạm thời trong việc phân tích dạng ở Việt nam. Tuy nhiên còn hạn chế: Hạn chế HPLC là việc xử lý mẫu, lựa chọn cột tách, nền mẫu phức tạp. Hạn chế ICP-MS; kết quả đo bị ảnh hưởng bởi nền hữu cơ, tín hiệu thay đổi, trùng khối.
Chƣơng 2
THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.1.1. Hóa chất 2.1.1. Hóa chất
Tất cả hóa chất chuẩn được mua của Sigma Aldrich (Singapore).
Arsenobetaine: (AsB, M = 178,06 độ tinh khiết ≥ 95%) Axit dimethylarsinic: DMA, M = 183,93 độ tinh khiết ≥98%) Axit monomethylarsonic: MMA, M = 138,0 độ tinh khiết ≥98%) Arsenit: (AsIII), M = 197,84 độ tinh khiết > 99%
Sodium Arsenate dibasic heptahydrate: As(V), M = 312,01 độ tinh khiết
≥98%)
Các hóa chất khác của Đức gồm:
+ Nước deion -18 MΩ cm, từ hệ thống Millipore Milli-Q (Mỹ) + Acid nitric HNO3 65%,
+ Acid hydrocloric HCl 37%, + Methanol MeOH
+ Amoni cacbonat NH4(CO3)2 + Amoni hydroxit NH3 28% + EDTA,độ tinh khiết ≥98%) + Acid acetic CH3COOH
2.1.2. Chuẩn bị hóa chất và dung dịch chuẩn:
+ Pha dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000ppm từ chất gốc
Các chất chuẩn gốc gồm: AsB; DMA; MMA; As(V) được tính tốn lượng cân và cân chính xác trên cân phân tích sau đó được hịa tan và định mức bằng nước deion, lắc đều, bảo quản trong tủ lạnh -40C.
Riêng đối với As(III) cách pha như sau: Cân lượng mẫu đã tính tốn vào ống facol 15, dùng 400 µl NaOH 1M hịa tan, sau đó dùng 400 µl HCl 1M điều chỉnh
pH dung dịch nhỏ hơn 3 và định mức bằng dung dịch HCl 0,02M. Thu được dung dịch As(III) 1000ppm, môi trường HCl, pH <3.
Dung dịch này được bảo quản -40C, giữ trong bình nhựa, sử dụng trong một năm.
+ Pha dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp 5 dạng asen
Tất cả các dung dịch chuẩn gốc từng dạng được lấy ra khỏi tủ đông và được rã đơng đến nhiệt độ phịng. Sau đó hút từng dạng theo thể tích đã được tính tốn vào ống facol, định mức bằng nước deion, lắc đều, thu được hốn hợp MIX 5 dạng As có nồng độ 10ppm. Dung dịch này được bảo quản -40C, giữ trong bình nhựa , sử dụng trong 1 tháng.
Từ dung dịch 5 dạng As 10ppm, hàng ngày trước khi sử dụng, tiến hành pha dung dịch chuẩn hỗn hợp MIX 500ppb, trong nước deion ( pha loãng 20 lần.Từ đó tiến hành pha đường chuẩn hỗn hợp 5 dạng As có nồng độ : 5; 10; 20; 50: 100; ppb
+ Dung môi pha động
Dung dịch (NH4)2CO3 10mM:
Cân 0,9611(NH4)2CO3 và 0,1g EDTA cho vào bình định mức 1000ml, thêm
nước deion. Điều chỉnh pH 9 bằng NH3 5% Nếu pH <9, hoặc CH3COOH 5%, nếu pH > 9. Sau đó định mức đến vạch. Dung dịch này được lọc qua màng PE 0,45µm bằng bơm chân khơng, sau đó rung siêu âm loại khí hịa tan trong vịng 25 phút.
Dung dịch (NH4)2CO3 50mM:
Cân 4,8045g (NH4)2CO3 và 0,1g EDTA cho vào bình định mức 1000ml, thêm nước deion. Hiệu chỉnh pH 9 bằng NH3 5 % nếu pH <9, hoặc CH3COOH 5%. nếu pH > 9.
Sau đó định mức đến vạch. Dung dịch này được lọc qua màng PE 0,45µm bằng bơm chân khơng, sau đó rung siêu âm trong vòng 25 phút.
Dung dịch pha động này phải được chuẩn bị hàng ngày
+ Pha 100ml dung dịch nội chuẩn 50ppb từ dung dịch chuẩn gốc As(V) 1000ppm, Đức, pha loãng dung dịch bằng nước deion.
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị 2.1.3.1. Dụng cụ 2.1.3.1. Dụng cụ - Micropipet 100µl-5000µl; 100µl – 1000l, 10µl – 100l, Đức. - Ống đựng Eppendorf 2,0 ml. - Ống Facol 15ml. - Bình định mức 10ml, 500ml, Duran, Đức.
- Bộ lọc pha động và bơm chân khơng, màng lọc PE 0,45µm. - Cân phân tích SA 210 ± 0,0001g.
- Máy rung siêu âm - Máy lắc xốy
- Màng lọc 0,2 µm, 0,45 µm
Tất cả các dụng cụ thủy tinh trong phịng thí nghiệm và đồ nhựa, chai polyethylene và chai thuốc thử được làm sạch bằng cách ngâm trong dung dịch chất tẩy rửa, rửa bằng nước tinh khiết từ hệ thống Millipore Q50 và ngâm trong HNO3 (10% v/v) qua đêm. Tiếp đó rửa bằng nước deion và làm khơ trước khi sử dụng.
2.1.3.2. Thiết bị
Phân tích tổng hàm lượng các dạng As ( vơ cơ, hữu cơ) được tiến hành trên hệ Agilent ICP-MS 7700x (Mỹ) như Hình 2.1
Hệ ghép nối HPLC-ICP-MS dùng cho phân tích dạng As
Các dạng asen hữu cơ và vô cơ được tách ra khỏi nhau trên các cột sắc kí tương ứng theo pha động bằng hệ thống HPLC và từng dạng asen được nguyên tử hóa, ion hóa bằng dịng cảm ứng cao tần sau đó được xác định bằng detector khối phổ trên hệ thiết bị như Hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ ghép nối HPLC-ICP-MS
ICP-MS của Perkin Elmer EALN 9000 Hệ thống HPLC LC 10A của hãng
Shimadzu Hình 2.3.Hệ ghép nối HPLC-ICP-MS dùng cho phân tích dạng As
(Khoa hóa học - Trường Đại học khoa học Tự nhiên)
+ Lị phá mẫu vi sóng CEM MARS 6
Thơng số kỹ thuật:
- Khối lượng: 63,6 kg
- Màn hình cảm ứng: Màn hình cảm ứng bằng thủy tinh TFT-LED
- Thiết kế giá xoay:Giá xoay hoạt động ở trạng thái xoay liên tục hoặc xoay qua lại.
- Khoang vi sóng: Phủ nhiều lớp Teflon chịu được áp lực cao
- Nguồn điện: 200/208/230 VAC (200-253 VAC), 60 Hz, 15A @ 230 VAC 220/240 VAC (202-250 VAC), 50 Hz, 15A @ 240 VAC
- Tần số Magnetron: 2450 MHz
- Công suất nguồn phát: 1800W - Phát liên tục với nhiều mức công suất giúp điều khiển các phản ứng tốt hơn. (Phương pháp IEC 705 - 1988)
Hình 2.4. Thiết bị phân hủy mẫu
+ Thiết bị chiết mẫu bằng siêu âm VC505 của Sonics – USA:
Được sử dụng để chiết mẫu trong phịng thí nghiệm.Thiết kế đặc biệt chun dùng dể phát sóng siêu âm với cơng suất 500 W, 20 kHz, có điều khiển được cơng suất siêu âm, thời gian chiết.
Hình 2.5. Thiết bị chiết mẫu sử dụng sóng siêu âm
Tự động điều chỉnh cường độ sóng, dễ dàng thay đổi đầu khuấy Hiển thị hai hàng số trên màn hình tinh thể lỏng LCD
Điều khiển bằng vi xử lý cho độ chính xác cao Thời gian hoạt động liên tục :1 giây đến 1 giờ
Có chức năng chạy theo chu kỳ điều khiển từ 1 đến 59 giây Thông số kỹ thuật:
Bộ nguồn cung cấp • Cơng suất máy: 500 W • Tần số: 20 kHz • Kích thước : 235 H x 190 W x 340 D mm • Trọng lượng : 6,8 kg + Thiết bị đo pH 850 SI (Đức) Đặc tính kỹ thuật: - Khoảng đo độ pH: -2,000 ÷ +19,999 pH - Độ chính xác: tại 0,01/0,001 pH: ±0,01/±0,005
- Khoảng đo độ dẫn điện: -1999,+1999mV- Độ chính xác: 0,3mV - Nhiệt độ: -5,0 +120,00C - Độ chính xác: ± 0,1K
2.2. Phƣơng pháp lấy mẫu, bảo quản, xử lý mẫu thực phẩm 2.2.1.Các loại mẫu đo
- Mẫu trắng: Sử dụng nước deion. - Mẫu chứng nhận CRM:
Mẫu chuẩn (CRM) asen trong bột gạo (ERM®-BC211) từ tài liệu tham khảo châu Âu, Viện tài liệu tham khảo và đo lường Bỉ, được chứng nhận cho As (III), As (V) và DMA, cũng như tổng nồng độ asen ,được sử dụng để xác nhận phương pháp phân tích tính chất của hợp chất asen trong các mẫu gạo.
Mơ cá ngừ (BCR®-627), từ tài liệu tham khảo Châu Âu, Viện vật liệu và Đo lường tham khảo Bỉ, được chứng nhận cho AsB, DMA cũng như hàm lượng asen tổng số.
Mẫu cá (DORM-4) Canada, được chứng nhận cho AsB cũng như hàm lượng asen tổng.
Các mẫu chuẩn chứng nhận được bảo quản cẩn thận trong điều kiện kín, ở nhiệt độ -4 oC. Sử dụng các loại mẫu chuẩn có nền mẫu tương tự với mẫu thực tế phân tích, để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích. Thơng qua 3 mẫu CRM cho phân tích asen tổng, 2 mẫu CRM cho phân tích dạng tồn tại của As.. (Các thơng tin mẫu CRM được đính kèm trong phụ lục).
2.2.2. Lấy mẫu
Trong nghiên cứu này 7 loại mẫu thực phẩm được thu thập ngẫu nhiên trên thị trường vào tháng 11 năm 2017 bao gồm:
1- Mẫu cá biển (thu thập biển Miền Trung Việt nam) 2- Mẫu mực (Quảng Ninh)
3- Mẫu tôm (Hà Nam) 4- Mẫu trai ( Hà Nam) 5- Mẫu gạo (Hà Nam)
6- Mẫu rong biển khô (Hàn Quốc) 7- Mẫu rong biển tươi ( Hàn Quốc)
Các mẫu: Gạo, tôm, trai, được thu thập tại Xã Chuyên Ngoại, Duy Tiên, Hà Nam, các mẫu được chứa trong các túi nhựa và bảo quản trong điều kiện -4 oC.Mẫu mực (Quảng Ninh), Rong tươi, rong khơ-Hàn Quốc, được mua trong siêu thị, có ghi rõ nguồn gốc xuất sứ.
2.2.3. Tiền xử lý mẫu Các mẫu hải sản Các mẫu hải sản
Các mẫu (cá, tôm, trai, mực) sau khi được thu thập tại các địa phương của Việt Nam, được sơ chế bằng cách loại bỏ các phần không sử dụng được làm thực phẩm (đầu, da, nội tạng, xương, vỏ). Sau đó được tiến hành đơng khơ ở -50oCvà nghiền mịn. Mẫu được bảo quản trong ống Falcon bằng polypropylen ở -20o
C cho tới khi tiến hành phân tích. Hàm lượng nước trong mẫu được xác định bằng sự chênh lệch khối lượng trước và sau khi đông khô.
Mẫu rong biển:
Mẫu rong tươi: Rong tươi lấy về rửa sạch cát, cát dài 5 cm, cho vào máy đông khô, thời gian đông khô khoảng 48 giờ ( nhìn vào biểu đồ ẩm cho đến khi hàm lượng ẩm nhỏ hơn 2% và đồ thị nằm ngang ổn định cỡ 5 giờ). Mẫu rong sau đó được nghiền mịn đồng nhất và cất giữ ở nhiệt độ -20 oC.
Mẫu rong khô: Rong khô được tiến hành đơng khơ mất nước, sau đó được nghiền mịn, đồng nhất và bảo quản ở nhiệt độ -20 oC.
Lưu ý: Trong tiền xử lý mẫu, mẫu rong được xử lý theo 2 phương pháp: đông khô và sấy khô. Đối với các mẫu sinh học (động, thực vật) để tránh biến đổi dạng của asen người ta tiến hành sử lý theo phương pháp đơng khơ (Lyophillise). Nhưng vì mẫu rong với đặc điểm có hàm lượng nước cao và khi khơ trở lại rất dai, nên áp dụng phương pháp đơng khơ thì mất nhiều thời gian và cần thiết bị đơng khơ loại lớn. Do vậy có thể sử dụng phương pháp sấy khô[50]. Trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 50-55 o
C. Kết quả phân tích hàm lượng tổng và dạng asen thu được tương đương nhau. Như vậy đối với mẫu rong biển có thể tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp sấy khô vừa đơn giản lại rút ngắn được thời gian.
Mẫu gạo: Mẫu gạo được nghiền mịn, và tiến hành đông khô (mất nước)
giống như trên và được bảo quản kín, ở -4 oC.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.3.1.Điều kiện tối ƣu thông số trên thiết bị đo tổng và dạng As
Các điều kiện phân tích tổng asen trên ICP-MS 7700x cài đặt theo thông số như Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Thông số kỹ thuật và điều kiện vận hành thiết bị (ICP-MS 7700x (Mỹ))
Thông số máy Giá trị
Hệ ICP-MS Agilelnt ICP-MS 7700x (Mỹ)
Công suất cao tần (RF Power) 1250W
Độ sâu mẫu (Smpl Depth) 8,0 mm
Khí mang (Carrier Gas) 1,05 l/min
Khí tạo plasma (Plasma gas) 15 l/min
Khí phụ trợ (Auxiliary gas) 0,9 l/min
Áp suất chân không (khi đo mẫu) 1,10-4 – 2,10-3 Pa Áp suất chân không (khi để máy Standby) 1,10-5 – 6,10-4 Pa
Water RF/WC/IF 48 vòng/phút Tốc độ bơm mẫu 0,3 rps Tốc độ bơm rửa 0,3 rps Nhiệt độ nước làm mát 200C Nước làm mát 2,4 l/phút Dạng phổ Full Quant (3)
Thời gian đo cho 1 chỉ tiêu 0,09 giây
Số lần đo lặp 3 lần
Các điều kiện phân tích dạng As trên hệ ghép nối HPCL-ICP-MS trong đó khảo sát và cài đặt thông số như Bảng 2.2.