3.2.7. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng ion Clo
Trong phép đo ICP – MS, ion clo có thể kết hợp với khí agon để hình thành ion ArCl+ có m/z = 75 trùng với số khối của asen và gây ảnh hưởng dương đến kết quả phân tích. Vì vậy, khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng Cl-
trong quá trình xác định asen bằng hệ thiết bị HPLC-ICP-MS là rất cần thiết.
Hình 3.13. Sắc đồ của 100 µg mL-1 clorua trên cột trao đổi anion mạnh Hamilton
PRP X100
Chuẩn bị các hỗn hợp chứa đồng thời năm dạng asen (AsB, As(III) MMA, DMA và As(V) ở nồng độ 50µg/l với hàm lượng Cl- được thêm vào ở các mức nồng độ 100mg/l; 200 mg/l; 500mg/l và 1000mg/l. Thành phần pha động sử dụng là hỗn hợp đệm 10mM và 50mM (NH4)2CO3 (EDTA); pH 9,0; thể tích bơm mẫu là 100 µl và tốc độ pha động là 1,2 ml/phút.
Hình 3.14. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 50ppb
pha động là hỗn hợp đệm (NH4)2CO3 10mM, 50mM (EDTA); pH=9; 2% MeOH;
vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,2 ml/phút.
Kết quả chỉ ra rằng khi sử dụng hệ ghép nối HPLC-ICP/MS, ion Cl- bị rửa giải ngay ở những giây đầu tiên trên cột, vì vậy khơng ảnh hưởng đến kết quả phân tích 5 dạng As. Tuy nhiên, khi hàm lượng ion Cl- ở nồng độ cao hơn có thể sẽ là nguyên nhân gây quá tải cho cột và ảnh hưởng đến độ phân giải của pic cho từng dạng asen vì vậy chúng tơi chỉ khảo sát đến hàm lượng 1g/l. Như vậy nồng độ ion Cl- đến 1000 mg/l không ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích.
3.3. Nghiên cứu tối ƣu hóa q trình chiết mẫu.
3.3.1. Khảo sát sơ bộ ảnh hƣởng đơn biến của các yếu tố
Các thí nghiệm thăm dị được tiến hành, sử dụng hệ dung mơi chiết bao gồm metanol và nước với tỉ lệ khác nhau. Trong q trình chiết cố định cơng suất sóng siêu âm và thời gian chiết. Bốn mẫu cá khác nhau được chiết với tỉ lệ metanol-nước khác nhau thể hiện trong bảng 3.5 và chiết lặp 3 lần. Dịch chiết lặp được gom lại trong ống falcon PP 15 ml. Nồng độ tổng As trong dịch chiết được đo bằng ICP-MS
Bảng 3.5: Hàm lượng các hợp chất As trong nền mẫu cá sử dụng hệ dung môi metanol-nước
TT Tỉ lệ MeOH/H2O(v/v) Hàm lượng As trong dịch chiết (ng/ml)
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4
1 100/0 103,4 153,7 124,9 72,5 2 90/10 105,4 145,7 136,2 82,3 3 80/20 108,1 163,7 151,3 75,0 4 70/30 114,7 174,2 158,9 75,7 5 60/40 118,3 197,1 163,7 88,2 6 50/50 129,3 204,6 188,4 93,3
Dựa vào kết quả phân tích tổng trong Bảng 3.5 nhận thấy tỉ lệ metanol / nước 50 / 50 là tốt nhất cho chiết các hợp chất As. Khi tăng tỉ lệ nước trong dung môi chiết, nồng độ của As trong dịch chiết không tăng. Do đó, dung mơi chứa hỗn hợp metanol và nước với tỉ lệ bằng nhau được sử dụng làm dung môi chiết. Tuy nhiên trong q trình chiết cịn phụ thuộc vào thời gian chiết và cơng suất chiết, việc tìm được tỉ lệ dung môi chưa phản ánh được hết điều kiện tối ưu.
Do vậy cần tiến hành đồng thời các yếu tố dung môi, công suất, thời gian.
3.3.2. Tối ƣu quá trình chiết tổng hàm lƣợng As bằng quy hoạch hóa thực nghiệm
Bố trí thí nghiệm được thực hiện theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken, với 15 thí nghiệm trong đó có 3 thí nghiệm tại tâm. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Mode Vesion 5.0 để tối ưu hóa q trình chiết mẫu cá.
3.3.2.1. Chọn các yếu tố ảnh hƣởng
Các thí nghiệm thăm dị được tiến hành nhằm xác định mức thí nghiệm của các yếu tố đầu vào (bao gồm tỷ lệ dung môi, cơng suất và thời gian chiết). Từ kết quả thí nghiệm đơn yếu tố đã thu được tỷ lệ về thể tích dung mơi MeOH /H2O thích hợp là 50/50 và chọn mức ở tâm là 50%, mức trên là 60 và mức dưới là 40 cho
nghiên cứu. Công suất thiết bị chiết: mức ở tâm là 60% mức trên là 80% mức dưới là 40%. Thời gian chiết: mức ở tâm là 4 phút, mức dưới là 2 phút mức trên là 6 phút Phương trình hồi quy bậc 2 về mối tương quan giữa biến phụ thuộc và biến độc lập;
X1- Tỷ lệ dung môi MeOH/H2O (% v/v) X2- Công suất siêu âm (%)
X3- Thời gian siêu âm (phút) Phương trình có dạng:
Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b1(X1)2 + b2(X2)2 + b3(X3)2 + b1,2,3(X1X2X3)
3.3.2.2. Thiết kế thí nghiệm
Ma trận thí nghiệm được thiết kế theo mơ hình mặt mục tiêu Box Behnken với sự trợ giúp của phần mềm Modde 5.0. Các yếu tố đầu vào được khảo sát với các mức khác nhau và được mã hóa như trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khảo sát mức biến thiên của các yếu tố
Biến nghiên cứu Mã hóa Đơn vị Mức nghiên cứu
-1 0 +1
Tỷ lệ MeOH/H2O X1 v/v 40 50 60
Công suất X2 % 40 60 80
Thời gian X3 phút 2 4 6
Các yếu tố này gọi là biến độc lập (xi). Hàm lượng được gọi là biến phụ thuộc (hàm số Y, %). Ma trận quy hoạch thực nghiệm thu được gồm 15 mẫu. Các điều kiện trình tự tiến hành,kết quả thí nghiệm như bảng 3.7.
Bảng 3.7. Bảng thực nghiệm nghiên cứu điều kiện chiết mẫu cá theo phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm
STT Mã hóa Mẫu Khối lƣợng mẫu (mg) Tỉ lệ MeOH/H2O (% v/v) công suất siêu âm(%) Thời gian (phút) Hàm lƣợng tổng As (mg/kg) 1 CÁ-1 52,98 40 40 4 22,33 2 CÁ-2 51,30 60 40 4 21,20 3 CÁ-3 50,38 40 80 4 24,45 4 CÁ-4 46,89 60 80 4 23,32 5 CÁ-5 50,04 40 60 2 23,81 6 CÁ-6 48,18 60 60 2 21,72 7 CÁ-7 50,02 40 60 6 24,32 8 CÁ-8 49,65 60 60 6 22,45 9 CÁ-9 45,57 50 40 2 26,25 10 CÁ-10 50,77 50 80 2 27,51 11 CÁ-11 46,62 50 40 6 26,84 12 CÁ-12 44,82 50 80 6 28,25 13 CÁ-13 51,34 50 60 4 27,81 14 CÁ-14 45,02 50 60 4 27,54 15 CÁ-15 47,04 50 60 4 27,64
3.3.2.3. Tiến hành chiết mẫu cá biển và phân tích tổng As
Cân khoảng 50mg mẫu cá biển vào ống fancol 15ml, thêm dung môi chiết vào, dùng thiết bị chiết siêu âm tiến hành chiết lặp 3 lần mỗi lần theo thể tích dung mơi là 3;3;4ml tổng thể tích là 10 ml. Tùy từng mẫu chiết theo điều kiện xây dựng mơ hình, sau mỗi lần chiết đầu dò được tiến hành rửa sạch bằng nước đeion và dùng khăn lau khô giữa các lần chạy mẫu, các mẫu sau khi chiết được tiến hành ly tâm ở 8000 vịng/phút trong 15 phút và phần dung dịch phía trên dùng đầu côn hút
sang ống facol khác. Quy trình này được áp dụng trong 3 lần trong suốt q trình tối ưu hóa phương pháp.
Nồng độ asen trong mẫu cá sau khi chiết được, pha loãng bằng dung dịch HN03 2% sau đó tiến hành đo tổng As trên thiết bị ICP-MS.7700x Agilent.
3.3.2.4. Xử lý số liệu tìm điều kiện tối ƣu
Sau khi đưa các biến độc lập vào phần mềm Modde 5.0, phần mềm đưa ra kết quả thiết kế gồm 15 thí nghiệm (Bảng 3.7). Tiến hành 15 thí nghiệm theo thiết kế. Nhập kết quả thực nghiệm vào phần mềm Modde 5.0, nhận được phương trình bề mặt đáp ứng sau: Căn cứ theo Bảng 3.8.
Y= 27,66 -0,777X1 + 0,863X2 + 0,32X3 - 4,48X12 - 0,35X22 - 0,100X32 + 0,05 X1X3 + 0,037X2X3.
Trong đó Y là hàm số: Biến phụ thuộc
X là biến độc lập: X1 là tỉ lệ % về thể tích MeOH/H2O; X2 là công suất siêu âm, X3 là thời gian chiết.
Các biến ảnh hưởng thể hiện trên biểu đồ Hình 3.15.