(pha động là đệm KH2PO4 20mM, pH=8; 2% MeOH; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ
dịng 1,2ml/phút)
Hình 3.3. Sắc ký đồ tách 5 dạng As nồng độ 100 ng/ml
(sử dụng hệ đệm (NH4)2CO3 pH=9 làm pha động 2% MeOH; vịng lặp mẫu 100µl;
tốc độ dịng 1,2ml/phút)
Kết quả trên hình 3.2 và 3.3 cho thấy tín hiệu peak khi sử dụng đệm amonicacbonat tốt hơn, đặc biệt là tín hiệu của As(III) và AsB. Hơn nữa, khi sử dụng đệm photphat trong một thời gian dài sẽ làm bề mặt côn của thiết bị ICP-MS
bị rỗ, làm giảm tuổi thọ và tín hiệu đo của thiết bị này. Vì vậy chúng tơi chọn pha động là đệm amonicacbonat cho các lần khảo sát tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pH.
Các dạng asen có sự khác nhau lớn về hằng số axit Ka, As3+ có pKa = 9,2; As5+ có pKa = 2,3; 6,8 và 11,6 trong khi đó MMA có pKa = 3,6 và 8,2; DMA có pKa = 1,3 và 6,2, chính vì vậy chúng có thể tách tốt bằng phương pháp trao đổi ion. Đây cũng chính là lí do khiến pH quyết định khả năng tách các dạng asen trên cột sắc kí Hamilton PRP-X 100.
Tiến hành thí nghiệm với năm dạng asen: AsB, As(III) MMA, DMA và As(v) ở nồng độ 50 µg/l với điều kiện pha động gồm đệm (NH4)2CO3 50mM; 2% MeOH; thể tích bơm mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,2 ml/phút và thay đổi pH lần lượt các giá trị từ 7,0 đến 9,0 với bước nhảy là 0,5. Kết quả thực nghiệm cho thấy khi sử dụng phương pháp đẳng dịng thì AsB và As3+ khơng tách được khỏi nhau. Ở các giá trị pH khác nhau thì thời gian lưu của 4 dạng As (AsB, As3+, MMA, DMA) không thay đổi nhiều. Riêng thời gian lưu của As5+
tăng khi pH tăng. Tuy nhiên, ở pH 9 thì tín hiệu đo ổn định nhất, vì vậy chúng tôi chọn pH của pha động bằng 9 cho các lần khảo sát tiếp theo.
Hình 3.4. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 50ppb,(pha động là đệm (NH4)2CO3
3.2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ EDTA, MEOH
Tiến hành sơ bộ cho thấy khi có EDTA trong pha động thì tín hiệu píc tách ra tốt hơn. Do đó trong nghiên cứu sự có mặt của EDTA là rất quan trọng khi nồng độ sắt và kim loại kiềm (canxi, magiê, vv) cao, đặc biệt là trong các mẫu môi trường và sinh học [17]. Trong nghiên cứu này, EDTA 0,01% đã được thêm vào pha động và nồng độ được giữ liên tục cho các thí nghiệm tiếp theo. Ngồi ra các dung mơi hữu cơ có khả năng làm tăng tín hiệu ICP-MS khi phân tích các nguyên tố có năng lượng ion hóa trong khoảng 9-11eV và để cải tiến độ nhạy do hiệu ứng cacbon thì một tỉ lệ nhỏ methanol đã được thêm vào pha động trong suốt q trình tối ưu hóa.
Để khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ phần trăm methanol đến khả năng tách các dạng asen trên cột sắc kí Hamilton PRP-X 100, chúng tơi tiến hành phân tích hỗn hợp năm dạng asen (AsB, As(III), MMA, DMA và As(V)) với nồng độ mỗi dạng asen là 50 µg/l. Thành phần pha động sử dụng là hỗn hợp đệm 10mM và 50mM (NH4)2CO3 (EDTA 0,01%), pH 9,0; tốc độ pha động 1,2 mL/phút và thể tích bơm mẫu là 100 µl nhưng chúng tơi thay đổi nồng độ của methanol trong pha động theo các tỉ lệ: 1%, 2%, 3%, 4%, 5% về thể tích. Kết quả thu được ở hình 3.5.
Hình 3.5. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 50ppb( pha động là hỗn hợp đệm
(NH4)2CO3 10, 50mM (EDTA 0,01%); pH 9; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng
Ở cả 5 nồng độ khác nhau của MeOH, 5 dạng As đều được tách hồn tồn, tín hiệu của As tăng lên khi tăng nồng độ MeOH nhưng đồng thời tín hiệu của đường nền cũng tăng lên. Tại nồng độ MeOH là 1%, 2%, 3% thì tín hiệu của đường nền thấp hơn ở 4% và 5%. Nhận thấy tại nồng độ 2% MeOH, đỉnh píc cao hơn, đối xứng và tín hiệu tách ổn định hơn. Vì vậy chúng tơi chọn nồng độ methanol 2% cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.4. Ảnh hƣởng của cabon trong pha động tới cƣờng độ As
Để nghiên cứu ảnh hưởng của cacbon đến tín hiệu As. Bộ van bơm mẫu sau cột được sử dụng. Nồng độ As(V) 50ppb sử dụng làm nội chuẩn, chi tiết về thực nghiệm trình bày trong chương 2.
Hình 3.6. Sắc đồ đường nền
sử dụng phương pháp đẳng dòng Gradient(pha động là đệm (NH4)2CO3; pH=9; 2% MeOH; vòng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,2ml/phút)
Hình 3.7. Sắc đồ50ppb AsV bơm lặp 2 phút /lần
phương pháp đẳng dòng Gradient(pha động là đệm (NH4)2CO3 50mM; pH=9; 2% MeOH; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,2ml/phút) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 4 8 12 16 20 A s in te n si ty/ cp s Time/min 0 100000 200000 300000 400000 0 5 10 15 20 A s in e n si ty/ cp s time/min
Như trên Hình 3.6 và Hình 3.7. Tín hiệu phân tích (chiều cao, hoặc diện tích pic) của As phụ thuộc vào gradient của pha động. Cụ thể là phụ thuộc vào nồng độ của (NH4)2CO3 trong pha động. Khi nồng độ của (NH4)2CO3 trong pha độngthấp 10mM thì tín hiệu thu được là cao nhất. Khi nồng độ (NH4)2CO3 pha động tăng lên thì tín hiệu giảm. Khi (NH4)2CO3 đạt 50mM thì tín hiệu giảm, đạt cực trị. Điều này
được lý giải là khi tăng nồng độ (NH4)2CO3 thì lượng cacbon đi vào plama tăng làm
ức chế q trình ion hóa. Bên cạnh đó nồng độ (NH4)2CO3 tăng thì hiệu quả của q
trình tạo sol khí cũng tăng, do tính chất vật lý của pha động thay đổi( độ nhớt, tỷ trọng,...)
Hình 3.8. Sắc đồ đường nền, khơng gradient
Hình 3.9. Sắc đồ 50ppb As(V) pha động là H2O, không gradient bơm lặp 2 phút/lần
0 100 200 300 400 500 600 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 A s in te n si ty/ cp s time/min 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 5 7 9 11 13 15 17 19 21 A s in te n si ty/c p s time/min
Như hình 3.8 và Hình 3.9. Tín hiệu phân tích của As gần như không thay đổi theo thời gian nếu pha động sử dụng là nước deion.
Bên cạnh đó nếu so sánh tín hiệu phân tích trong nước cất và trong pha động (Hình 3.7 và 3.9) thì tín hiệu phân tích tăng từ 4-5 lần khi sử dụng pha động thay cho nước cất. Điều này được giải thích là do sự có mặt của cacbon trong plasma. Khi có mặt cacbon trong plasma thì phản ứng trao đổi điện tích giữa các ion phân tích với các ion có nguồn gốc từ cacbon như: C+, Co+, C2+...
Do đó hiệu quả của q trình ion hóa tăng lên. Điều này được đề cập một cách hệ thống và chi tiết trong nghiên cứu của (Frank Vanhaecke và đồng nghiệp, 2013). Tỷ số tín hiệu phân tích tăng khi sử dụng pha động tìm được trong nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Frank và đồng nghiệp.[11]
3.2.5. Khảo sát lựa chọn chế độ đo đẳng dòng hoặc gradient pha động.
Để khảo sát ảnh hưởng của hai phương pháp rửa giải đến khả năng tách các dạng asen trên cột sắc kí Hamilton PRP-X 100, chúng tơi tiến hành phân tích hỗn hợp năm dạng asen (AsB, As3+, MMA, DMA và As5+) với nồng độ mỗi dạng asen là 50 µg/L. Tốc độ pha động 1,2 mL/phút; thể tích bơm mẫu là 100 µl; 2% MeOH. Đối với phương pháp đẳng dịng, chúng tơi sử dụng pha động là đệm amonicacbonat (NH4)2CO3 ở một nồng độ duy nhất là 50mM, pH 9. Còn đối với phương pháp gradient chúng tôi cũng tiếp tục sử dụng đệm (NH4)2CO3 nhưng nồng độ ở 10mM và 50mM (EDTA), pH 9. + Chương trình gradient: Kênh A: MeOH Kênh B: Đệm amonicacbonat (NH4)2CO3 50mM Kênh C: Đệm amonicacbonat (NH4)2CO3 10mM Kênh D: H2O - Từ 0 đến 1 phút: 10mM đệm amonicacbonat + 2% MeOH - Từ 1 đến 15 phút: 50mM đệm amonicacbonat + 2% MeOH - Từ 15 đến 20 phút: 10mM đệm amonicacbonat + 2% MeOH
Hình 3.10. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 50ppb
sử dụng phương pháp đẳng dòng pha động là đệm (NH4)2CO3 50mM;EDTA 0,01%,
pH=9; 2% MeOH; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,2ml/phút.
Hình 3.11. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 50ppb
sử dụng phương pháp gradient pha động là hỗn hợp đệm (NH4)2CO3, (EDTA
0,01%); pH=9; 2% MeOH; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,2 ml/phút.
Kết quả cho thấy khi sử dụng phương pháp gradient, 5 dạng As được tách hồn tồn. Cịn khi sử dụng phương pháp đẳng dịng thì AsB và As(III) khơng tách được khỏi nhau. Vì vậy, chọn phương pháp gradient cho việc tách 5 dạng As trên hệ ghép nối HPLC-ICP-MS.
3.2.6. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ dòng pha động
Tốc độ pha động ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng tách của các dạng asen. Khi tốc độ pha động cao đồng nghĩa với thời gian rửa giải các dạng asen sẽ ngắn, nhưng nếu tốc độ pha động quá chậm sẽ ảnh hưởng đến độ phân giải các píc làm giãn rộng vùng mẫu, giảm tín hiệu phân tích. Chính vì vậy một tốc độ pha động hợp lí sẽ cho kết quả tối ưu nhất.
Tiến hành phân tích hỗn hợp năm dạng asen (AsB, As(III), MMA, DMA và As(v) với nồng độ mỗi dạng asen là 50 µg/l. Thành phần pha động là hỗn hợp đệm 10 mM và 50 mM (NH4)2CO3 (EDTA 0,01%); pH 9,0; thể tích bơm mẫu là 100 µl và tiến hành khảo sát ở 3 tốc độ pha động là 1,0 ml/phút; 1,2 ml/phút và 1,5 ml/phút.
Ở tốc độ 1,2 ml/phút 5 dạng As được tách hồn tồn riêng lẻ, cịn ở tốc độ 1,0ml/phút và 1,5ml/phút AsB, As(III) và DMA tách ra gần nhau. Ở tốc độ 1.5ml/phút tín hiệu peak của MMA và As(V) bị thấp, do vậy chúng tơi chọn tốc độ dịng pha động là 1,2 ml/phút cho các khảo sát tiếp theo.
Hình 3.12. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 50ppb
3.2.7. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng ion Clo
Trong phép đo ICP – MS, ion clo có thể kết hợp với khí agon để hình thành ion ArCl+ có m/z = 75 trùng với số khối của asen và gây ảnh hưởng dương đến kết quả phân tích. Vì vậy, khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng Cl-
trong quá trình xác định asen bằng hệ thiết bị HPLC-ICP-MS là rất cần thiết.
Hình 3.13. Sắc đồ của 100 µg mL-1 clorua trên cột trao đổi anion mạnh Hamilton
PRP X100
Chuẩn bị các hỗn hợp chứa đồng thời năm dạng asen (AsB, As(III) MMA, DMA và As(V) ở nồng độ 50µg/l với hàm lượng Cl- được thêm vào ở các mức nồng độ 100mg/l; 200 mg/l; 500mg/l và 1000mg/l. Thành phần pha động sử dụng là hỗn hợp đệm 10mM và 50mM (NH4)2CO3 (EDTA); pH 9,0; thể tích bơm mẫu là 100 µl và tốc độ pha động là 1,2 ml/phút.
Hình 3.14. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 50ppb
pha động là hỗn hợp đệm (NH4)2CO3 10mM, 50mM (EDTA); pH=9; 2% MeOH;
vòng lặp mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,2 ml/phút.
Kết quả chỉ ra rằng khi sử dụng hệ ghép nối HPLC-ICP/MS, ion Cl- bị rửa giải ngay ở những giây đầu tiên trên cột, vì vậy khơng ảnh hưởng đến kết quả phân tích 5 dạng As. Tuy nhiên, khi hàm lượng ion Cl- ở nồng độ cao hơn có thể sẽ là nguyên nhân gây quá tải cho cột và ảnh hưởng đến độ phân giải của pic cho từng dạng asen vì vậy chúng tơi chỉ khảo sát đến hàm lượng 1g/l. Như vậy nồng độ ion Cl- đến 1000 mg/l không ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích.
3.3. Nghiên cứu tối ƣu hóa q trình chiết mẫu.
3.3.1. Khảo sát sơ bộ ảnh hƣởng đơn biến của các yếu tố
Các thí nghiệm thăm dị được tiến hành, sử dụng hệ dung mơi chiết bao gồm metanol và nước với tỉ lệ khác nhau. Trong q trình chiết cố định cơng suất sóng siêu âm và thời gian chiết. Bốn mẫu cá khác nhau được chiết với tỉ lệ metanol-nước khác nhau thể hiện trong bảng 3.5 và chiết lặp 3 lần. Dịch chiết lặp được gom lại trong ống falcon PP 15 ml. Nồng độ tổng As trong dịch chiết được đo bằng ICP-MS
Bảng 3.5: Hàm lượng các hợp chất As trong nền mẫu cá sử dụng hệ dung môi metanol-nước
TT Tỉ lệ MeOH/H2O(v/v) Hàm lượng As trong dịch chiết (ng/ml)
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4
1 100/0 103,4 153,7 124,9 72,5 2 90/10 105,4 145,7 136,2 82,3 3 80/20 108,1 163,7 151,3 75,0 4 70/30 114,7 174,2 158,9 75,7 5 60/40 118,3 197,1 163,7 88,2 6 50/50 129,3 204,6 188,4 93,3
Dựa vào kết quả phân tích tổng trong Bảng 3.5 nhận thấy tỉ lệ metanol / nước 50 / 50 là tốt nhất cho chiết các hợp chất As. Khi tăng tỉ lệ nước trong dung môi chiết, nồng độ của As trong dịch chiết không tăng. Do đó, dung mơi chứa hỗn hợp metanol và nước với tỉ lệ bằng nhau được sử dụng làm dung môi chiết. Tuy nhiên trong q trình chiết cịn phụ thuộc vào thời gian chiết và cơng suất chiết, việc tìm được tỉ lệ dung môi chưa phản ánh được hết điều kiện tối ưu.
Do vậy cần tiến hành đồng thời các yếu tố dung môi, công suất, thời gian.
3.3.2. Tối ƣu quá trình chiết tổng hàm lƣợng As bằng quy hoạch hóa thực nghiệm
Bố trí thí nghiệm được thực hiện theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken, với 15 thí nghiệm trong đó có 3 thí nghiệm tại tâm. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Mode Vesion 5.0 để tối ưu hóa q trình chiết mẫu cá.
3.3.2.1. Chọn các yếu tố ảnh hƣởng
Các thí nghiệm thăm dị được tiến hành nhằm xác định mức thí nghiệm của các yếu tố đầu vào (bao gồm tỷ lệ dung môi, công suất và thời gian chiết). Từ kết quả thí nghiệm đơn yếu tố đã thu được tỷ lệ về thể tích dung mơi MeOH /H2O thích hợp là 50/50 và chọn mức ở tâm là 50%, mức trên là 60 và mức dưới là 40 cho
nghiên cứu. Công suất thiết bị chiết: mức ở tâm là 60% mức trên là 80% mức dưới là 40%. Thời gian chiết: mức ở tâm là 4 phút, mức dưới là 2 phút mức trên là 6 phút Phương trình hồi quy bậc 2 về mối tương quan giữa biến phụ thuộc và biến độc lập;
X1- Tỷ lệ dung môi MeOH/H2O (% v/v) X2- Công suất siêu âm (%)
X3- Thời gian siêu âm (phút) Phương trình có dạng:
Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b1(X1)2 + b2(X2)2 + b3(X3)2 + b1,2,3(X1X2X3)
3.3.2.2. Thiết kế thí nghiệm
Ma trận thí nghiệm được thiết kế theo mơ hình mặt mục tiêu Box Behnken với sự trợ giúp của phần mềm Modde 5.0. Các yếu tố đầu vào được khảo sát với các mức khác nhau và được mã hóa như trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khảo sát mức biến thiên của các yếu tố
Biến nghiên cứu Mã hóa Đơn vị Mức nghiên cứu
-1 0 +1
Tỷ lệ MeOH/H2O X1 v/v 40 50 60
Công suất X2 % 40 60 80
Thời gian X3 phút 2 4 6
Các yếu tố này gọi là biến độc lập (xi). Hàm lượng được gọi là biến phụ thuộc (hàm số Y, %). Ma trận quy hoạch thực nghiệm thu được gồm 15 mẫu. Các điều kiện trình tự tiến hành,kết quả thí nghiệm như bảng 3.7.
Bảng 3.7. Bảng thực nghiệm nghiên cứu điều kiện chiết mẫu cá theo phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm
STT Mã hóa Mẫu Khối lƣợng mẫu (mg) Tỉ lệ MeOH/H2O (% v/v) công suất siêu âm(%) Thời gian (phút) Hàm lƣợng tổng As (mg/kg) 1 CÁ-1 52,98 40 40 4 22,33 2 CÁ-2 51,30 60 40 4 21,20 3 CÁ-3 50,38 40 80 4 24,45 4 CÁ-4 46,89 60 80 4 23,32 5 CÁ-5 50,04 40 60 2 23,81 6 CÁ-6 48,18 60 60 2 21,72 7 CÁ-7 50,02 40 60 6 24,32 8 CÁ-8 49,65 60 60 6 22,45 9 CÁ-9 45,57 50 40 2 26,25 10 CÁ-10 50,77 50 80 2 27,51 11 CÁ-11 46,62 50 40 6 26,84 12 CÁ-12 44,82 50 80 6 28,25 13 CÁ-13 51,34 50 60 4 27,81 14 CÁ-14 45,02 50 60 4 27,54 15 CÁ-15 47,04 50 60 4 27,64
3.3.2.3. Tiến hành chiết mẫu cá biển và phân tích tổng As
Cân khoảng 50mg mẫu cá biển vào ống fancol 15ml, thêm dung môi chiết vào, dùng thiết bị chiết siêu âm tiến hành chiết lặp 3 lần mỗi lần theo thể tích dung