Thiết bị Giá trị cài đặt Thông số khảo sát HPLC (Shimadzu LC 10A) Cột tách Hamilton PRP-X100, L = 250 mm, d = 4,6 mm, dp= 10µm Nhiệt độ cột tách Nhiệt độ phịng (25-27 °C) Thành phần pha động Kênh A: 10 mM NH4)2CO3, pH 9,0 Kênh B: 50 mM (NH4)2CO3, pH 9,0
Tốc độ pha động 1,2 ml/phút, rửa giải theo
gradient
Thể tích mẫu 100 µl
ICP-MS (Perkin Elmer ELAN 9000)
Khí plasma 16 lít/phút
Khí phụ trợ 1,25 lít/phút
Khí tạo sol 0,8 lít/phút
Cơng suất plasma 1250 W
Bộ tạo sol PFA
Buồng phun Scott, double pass
Ion đo As+ (m/z 75), Cl+(m/z 37)
Thời gian đo 100 ms
Chế độ đo Peak hopping
Định lượng Phương pháp đường chuẩn và phương pháp nội chuẩn
Trong nghiên cứu này thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao model Shimadzu LC-10A (Shimadzu, Nhật bản) bao gồm: bộ loại khí cho pha động, bộ chọn dung
môi, bơm cao áp bốn kênh, buồng ổn nhiệt cho cột tách, bộ điều khiển trung tâm và phần mềm Lab Solution. Cột sắc ký trao đổi anion PRP-X100 (Hamilton, Mỹ) với kích thước hạt nhồi 10 µm, đường kính trong 4,6 mm, chiều dài cột tách 250 mm. Khối phổ kế nguyên tử nguồn ion hóa plasma cao tần cảm ứng ELAN 9000 (Perkin Elmer, Mỹ) với phần mềm ELAN 3.0 được sử dụng làm detector cho hệ HPLC. Phần mềm Xcalibur version 2.0 (Thermo Scientific, Mỹ) được sử dụng để chuyển đổi, xử lý số liệu và định lượng [4].
2.3.2. Phƣơng pháp xác định dạng tồn tại của As sử dụng hệ ghép nối HPLC- ICP-MS.
Năm hợp chất asen, AsB, As (III), DMA, MMA và As (V) được tách trên cột trao đổi anion mạnh Hamilton PRP X100 với pha động có chứa amoni cacbonat, EDTA và methanol với chế độ rửa giải gradient. Chương trình rửa giải Gradien cho sự hình thành các hợp chất asen được tối ưu hóa và được thể hiện trên Bảng 2.2. Tốc độ dịng chảy của pha động được giữ khơng đổi ở tốc độ dịng chảy 1,2 ml/phút trong q trình tách sắc ký. Dựa vào thời gian lưu của từng dạng, thứ tự tách 5 dạng As khỏi cột là: AsB, As(III), DMA, MMA, As(v). Để phát hiện, các hợp chất asen tách ra khỏi cột trao đổi anion được gửi trực tiếp tới hệ thống ICP- MS. Việc xác định các dạng asen được thực hiện bằng cách so sánh thời gian lưu của mỗi hợp chất trên cột trao đổi anion PRP- X100 (250 x 2,1 mm x 10 µm, Halminton, Mỹ) tại điều kiện thí nghiệm cụ thể và cường độ tín hiệu của phổ khối của As m/z:75.
2.3.3. Nghiên cứu bộ bơm mẫu sau cột (hệ ghép nối HPLC-ICP-MS) khắc phục ảnh hƣởng của cacbon.
Cacbon có nhiều trong phổ khối plasma cảm ứng (ICP-MS). Nó có thể được tìm thấy ở trong các mẫu mơi trường, dinh dưỡng, lâm sàng và hóa dầu. Ngồi ra, trong các dung môi hữu cơ được sử dụng trong q trình chuẩn bị mẫu (ví dụ: chiết / lấy mẫu) hoặc là dung môi rửa giải trong các kỹ thuật phân tích sắc ký. Sự có mặt của cacbon trong plasma là một nguồn gây nhiễu tín hiệu trong ICP-MS. Cacbon làm tăng cường độ của các nguyên tố theo thứ tự giảm khối lượng, điều này là do sự thay đổi không gian của vùng mật độ ion tối đa, ảnh hưởng đến việc tách ion từ
plasma đến detector. Các dung môi hữu cơ dễ bay hơi dễ dàng ngăn chặn tín hiệu các nguyên tố. Khi nồng độ methanol cao cũng ức chế cường độ của các nguyên tố do làm mát plasma.
Tín hiệu của các nguyên tố như: P, As, Se, Sb, Te, I, Au và Hg có sử dụng dung mơi hữu cơ luôn cao hơn so với dung mơi khơng có carbon. Bên cạnh đó cũng liên quan đến phản ứng chuyển tải tích điện trong các hạt có chứa cacbon trong plasma. Đặc trưng chủ yếu là C+
, ngoài ra CO+, CO+ 2, C+ 2 và ArC+ cũng có thể đóng một vai trị nhất định.[11]
Hình 2.6. Sơ đồ khối hệ HPLC-ICP-MS với bộ bơm mẫu sau cột
(dùng để bơm nội chuẩn và nghiên cứu các quá trình xảy ra trong plama khi rửa giải gradient)
Trên Hình 2.6 là bộ bơm mẫu sau cột, được tạo ra từ 1 bộ van bơm mẫu 6 cổng dùng cho HPLC.
Sử dụng bộ bơm mẫu sau cột để nghiên cứu sự ảnh hưởng của pha động( hàm lượng C trong pha động) tới tín hiệu phân tích của As khi đo bằng ICP-MS. Bộ bơm mẫu sau cột cho phép bơm dung dịch chuẩn As (nồng độ 50 ppb) tại mọi thời điểm của quá trình tách. Để đánh giá sự phụ thuộc tín hiệu phân tích vào gradient pha động ( lượng cacbon đi vào plasma) 100µl dung dịch chuẩn As(V) 50ppb trong HNO3 được bơm vào hệ thống sau mỗi 2 phút.
Một thí nghiệm hồn tồn tương tự cũng được tiến hành nhưng pha động được thay thế bằng nước deion. Sự phụ thuộc của diện tích pic của As(V) theo thời gian được dùng để đánh giá ảnh hưởng của gradient pha động đến tín hiệu của As.
So sánh tín hiệu của As trong pha động và trong nước deion có thể đánh giá được ảnh hưởng của cacbon đến tín hiệu phân tích. Bên cạnh đó bộ bơm mẫu sau cột cịn được sử dụng để bơm chất nội chuẩn không đặc trưng (Species-unsjecific
internal sbudound). Điều này đặc biệt có ý nghĩa đối với các nguyên tố cần phân tích mà chỉ có duy nhất một đồng vị bền (ví dụ như As, P, S ).
2.3.4. Nghiên cứu phƣơng pháp chiết mẫu siêu âm trích ly
Mục tiêu của nghiên cứu là áp dụng kỹ thuật này cho việc chiết siêu âm các loại mẫu thực phẩm, để giảm thời gian xử lý mẫu, tránh việc chuyển dạng của As. Điều kiện chiết được tối ưu hóa, phương pháp đã được xác nhận bằng mẫu chuẩn cá: DORM-4 và BCR-627.
Sơ đồ thiết bị phát sóng siêu âm
Hình 2.7. Thiết bị phát sóng siêu âm dạng thanh
Thiết bị phát sóng siêu âm cũng phải gồm có 3 phần tối cần thiết sau:
- Bộ phận chuyển phần lớn điện năng thành dòng điện xoay chiều tần số cao để vận hành bộ phận biến đổi .
- Bộ phận biến đổi chuyển dòng điện xoay chiều tần số cao thành những dao động.
Hệ thống truyền sóng sẽ truyền những dao động vào trong lịng chất lỏng. Điều kiện thí nghiệm:
Đặt sâu đầu siêu âm 1cm, thời gian siêu âm khảo sát từ 10- 180 giây, công suất siêu âm từ 40-80 %
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Phần mềm Xcalibur version 2.0 (Thermo Scientific, Mỹ) được sử dụng để chuyển đổi, xử lý số liệu và định lượng. Các pic riêng lẻ của từng dạng As được xác định tự động trên phần mềm Xcalibur dựa vào thời gian lưu của chúng (thời gian lưu đã được khai báo trên thiết bị). Từ diện tích pic và phương trình đường chuẩn, chúng tôi xác định được nồng độ các dạng As xuất hiện trong mẫu đo.
2.4. Quy trình phân tích xác định tổng và dạng As
Các mẫu phân tích dạng và tổng As được xác định theo trọng lượng khơ.
2.4.1.Phân tích tổng As
Phân hủy mẫu bằng lị vi sóng
Trong mẫu hải sản, và thực phẩm asen được liên kết chặt chẽ với các thành phần protein. Do đó trước khi định lượng, cần phá vỡ nền protein của mẫu để đưa về dạng vô cơ. Đây là phương pháp xử lý mẫu hiện đại làm giảm đáng kể thời gian xử lý mẫu, khơng làm mất mẫu phân tích và vơ cơ hóa mẫu được triệt để, có thể vơ cơ hóa cùng lúc nhiều mẫu. Sử dụng axit HNO3 và tác nhân ơxi hóa H2O2.
Các bƣớc tiến hành khi phân hủy mẫu bằng lị vi sóng
Cân chính xác khoảng: 50,0 – 200,0 mg mẫu thực phẩm đã được đông khô hoặc sấy khô. Tùy hàm lượng As có trong mẫu chọn lượng cân cho phù hợp. Cho vào bình xử lý mẫu bằng Teflon dung tích 100ml trong lị vi sóng (phá mẫu lặp). Thêm vào bình 5ml HNO3 đặc; 0,5ml H2O2 đặc). Tiến hành phá kèm mẫu trắng.
Đặt chƣơng trình phá mẫu qua 3 bƣớc:
Bước 1: cơng suất lị 30% – thời gian 3 phút Bước 2: cơng suất lị 50% – thời gian 5 phút Bước 3: cơng suất lị 45% – thời gian 15 phút.
Sau khi chương trình kết thúc để nguội về nhiệt độ phịng, pha lỗng mẫu sao cho nền mẫu có nồng độ HNO3 khoảng 2% sau đó định mức tới một thể tích xác định (25ml hoặc 50ml). Dung dịch mẫu được lọc qua màng lọc có đường kính lỗ 0,45μm. Tiến hành đo phổ ICP-MS theo các điều kiện nghiên cứu ở Bảng 2.1 để
định lượng asen tổng có trong mẫu.
Để đánh giá quy trình phân tích, chúng tơi tiến hành phân tích 2 mẫu chuẩn đối chiếu nền cá là DORM-4 và mẫu BCR-627 và 1 mẫu gạo BC-211.
2.4.2. Quy trình phân tích dạng As
Cân chính xác khoảng 50,00 mg mẫu thực phẩm chứa As cho vào ống facol 15ml. Dùng 10ml dung mơi MeOH:H2O theo tỉ lệ 50/50 về thể tích (chiết lặp 3 lần tương ứng 3;3;4 ml). Công suất chiết siêu âm 80%, thời gian chiết 2x3 phút, ly tâm 6000xg, thời gian ly tâm 5 phút. Dịch chiết được chuyển sáng ống facol mới và được pha loãng 10 lần bằng nước deion và lọc qua màng lọc 0,45µm. Sau đó được bơm vào cột sắc ký, đo 5 dạng hợp chất As trên thiết bị ghép nối HPLC-ICP-MS.
2.4.3. Sơ đồ phân tích tổng và dạng As
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích tổng hàm lƣợng As trong mẫu thực phẩm bằng phƣơng pháp ICP-MS
3.1.1. Khoảng tuyến tính
Phương pháp ICP-MS có vùng tuyến tính hơn hẳn tất cả các kỹ thuật phổ quang học khác. Hầu hết các pic phổ khối có vùng tuyến tính rất rộng, thường là từ hàng trăm đến hàng triệu lần nồng độ giới hạn dưới (tùy thuộc từng nguyên tố cần xác định).Thực tế hàm lượng As có trong mẫu thực phẩm thường rất nhỏ do đó đường chuẩn nên được xây dựng có nồng độ nhỏ: từ 1ppb đến 200ppb.[15]
Phương trình hồi quy của As đo bằng ICP-MS sử dụng cho phân tích tổng As có dạng là: Y(AΔA).X(BΔB);
Trong đó:
Y -là tín hiệu của As (cps) X- nồng độ As (ppb) Hệ số tương quan R2
Bảng 3.1. Cường độ tín hiệu của As+
phụ thuộc vào nồng độ của As trong ICP-MS
STT Nồng độ (ppb) Tín hiệu (cps) 1 0 55 2 5 24543 3 10 48090 4 20 104506 5 50 212448 6 100 433551 7 200 883674
Hình 3.1. Đường chuẩn xác định hàm lượng As tổng số bằng ICP-MS
Kết quả trên Hình 3.1 cho thấy phương trình đường chuẩn As có hệ số tương quan khá tốt (R2 =0,9994) và có giá trị độ lệchnhỏ hơn nhiều so với giá trị A. PT: Y=(4380,8±43)*X+ (2894,8±4208,5).
Tương ứng với giới hạn phát hiện: LOD = 0,032µg/l và giá trị giới hạn định lượng LOQ = 0,098µg/l.
3.1.2. Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp
Để xác nhận và đánh giá phương pháp phân tích tổng hàm lượng As, sử dụng 3 mẫu chuẩn CRM.
Quá trình xử lý 3 mẫu CRM. Được tiến hành theo quy trình ở mục 2.4.1 giống như các mẫu thực phẩm. Riêng mẫu gạo được cân vào ống tefenol và cho axit HNO3 để cách đêm trước khi phân hủy bằng lị vi sóng. Kết quả thu được tại Bảng 3.2. y = (4380,8 ± 48,3)*x + (2894,8 ± 4208,5) R² = 0,9994 0 200000 400000 600000 800000 1000000 0 50 100 150 200 ti n hiệu de tec tor As+ / cps nồng độ As, ppb
Bảng 3.2. Đánh giá quy trình phân tích trên mẫu chuẩn CRM TT Mẫu CRM Nồng độ As (mg/kg) Độ lệch TT Mẫu CRM Nồng độ As (mg/kg) Độ lệch tương đối % Phân tích được Chứng chỉ 1 DORM-4 (cá) 7,090,50 6,870,44 +3,24 2 BCR-627(cá) 5,090,37 4,800,30 + 6,04 3 BC-211( gạo) 0,249±0,04 0,260±0,01 -4,23
Kết quả thí nghiệm cho thấy sai khác giữa kết quả thực nghiệm và giá trị chứng nhận của các mẫu CRM là không đáng kể về mặt thống kê giá trị ttính < t bảng ở độ tin cậy 95%. Như vậy việc phân hủy mẫu bằng lò vi sóng như thực nghiệm trên có thể áp dụng vào quy trình phân tích để định lượng As tổng trong mẫu thực phẩm.
3.1.3. Độ chụm của phƣơng pháp
Để đánh giá độ chụm của phương pháp, tiến hành phân tích lặp 7 lần mẫu cá biển. Kết quả được thể hiện tại Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Đánh giá độ chụm của phương pháp thông qua mẫu cá biển
STT Loại mẫu Số lần lặp Kết quả (µg/l)
1 Mẫu cá biển lần-1 29,40 2 lần-2 28,40 3 lần-3 28,70 4 lần-4 27,58 5 lần-5 28,30 6 lần-6 29,10 7 lần-7 27,50 8 Trung bình Xtb 28,43 9 Độ lệch chuẩn SD 0,72 10 Độ lệch tƣơng đối RSD (%) 2,52
3.1.4. Kết quả phân tích tổng hàm lƣợng As trong một số mẫu thực phẩm
Áp dụng quy trình phân tích, tiến hành phân tích tổng hàm lượng As trong 7 mẫu thực phẩm: tơm, cá, mực, trai....số lần phân tích lặp lại là 3 lần. Kết quả chỉ ra tại bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả phân tích tổng hàm lượng As trong 1 số đối tượng thực phẩm bằng phương pháp ICP-MS
STT Tên mẫu Hàm lƣợng As trong mẫu (mg/kg) (Xtb±SD, n=3) 1 Cá 29,5 0,6 2 Tôm 3,40,1 3 Trai 6,30,3 4 Mực 24,50,4 5 Rong khô 54,20,3 6 Rong tươi 74,30,7 7 Gạo 0,220,05
Kết quả phân tích tổng asen trong 7 mẫu thực phẩm cho thấy hàm lượng của một số mẫu hải sản ví dụ như cá, tơm, mực, trai, có hàm lượng As tổng dao động trong khoảng từ 3,4-29,5 mg/kg. So với quy chuẩn quốc gia (QCVN 8- 2:2011/BYT) quy định giới hạn ô nhiễm asen thì đều vượt quá giới hạn cho phép là 1,0 mg/kg. Tuy nhiên đây là hàm lượng tổng nên không phản ánh được độc tính asen trong các mẫu nói trên. Đối với mẫu gạo có hàm lượng As tổng thấp, chưa vượt ngưỡng cho phép. Các mẫu rong biển có hàm lượng asen rất cao do đặc điểm sống trong môi trường biển, lượng asen cao do nhiễm từ nhiều nguồn khác nhau bao gồm tự nhiên và nhân tạo.
3.2. Khảo sát điều kiện tối ƣu phân tích dạng As bằng phƣơng pháp ghép nối HPLC-ICP-MS.
3.2.1. Khảo sát lựa chọn pha động
Để khảo sát ảnh hưởng của loại pha động đến khả năng tách các dạng asen trên cột sắc kí Hamilton PRP-X 100, tiến hành phân tích hỗn hợp năm dạng asen (AsB, As(III), MMA, DMA và As(V)) với nồng độ mỗi dạng asen là 100µg/l. Tốc độ pha động 1,2ml/phút; thể tích bơm mẫu là 100 µl; 2% MeOH. Hai loại pha động được chọn để khảo sát là đệm photphat KH2PO4 20mM, pH 8 và đệm amoni cacbonat (NH4)2CO3 50mM, pH 9.
Hình 3.2. Sắc đồ của 5 dạng As ở nồng độ 100 ng/ml
(pha động là đệm KH2PO4 20mM, pH=8; 2% MeOH; vịng lặp mẫu 100µl; tốc độ
dịng 1,2ml/phút)
Hình 3.3. Sắc ký đồ tách 5 dạng As nồng độ 100 ng/ml
(sử dụng hệ đệm (NH4)2CO3 pH=9 làm pha động 2% MeOH; vịng lặp mẫu 100µl;
tốc độ dịng 1,2ml/phút)
Kết quả trên hình 3.2 và 3.3 cho thấy tín hiệu peak khi sử dụng đệm amonicacbonat tốt hơn, đặc biệt là tín hiệu của As(III) và AsB. Hơn nữa, khi sử dụng đệm photphat trong một thời gian dài sẽ làm bề mặt côn của thiết bị ICP-MS
bị rỗ, làm giảm tuổi thọ và tín hiệu đo của thiết bị này. Vì vậy chúng tơi chọn pha động là đệm amonicacbonat cho các lần khảo sát tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pH.
Các dạng asen có sự khác nhau lớn về hằng số axit Ka, As3+ có pKa = 9,2; As5+ có pKa = 2,3; 6,8 và 11,6 trong khi đó MMA có pKa = 3,6 và 8,2; DMA có pKa = 1,3 và 6,2, chính vì vậy chúng có thể tách tốt bằng phương pháp trao đổi ion. Đây cũng chính là lí do khiến pH quyết định khả năng tách các dạng asen trên cột sắc kí Hamilton PRP-X 100.
Tiến hành thí nghiệm với năm dạng asen: AsB, As(III) MMA, DMA và As(v) ở nồng độ 50 µg/l với điều kiện pha động gồm đệm (NH4)2CO3 50mM; 2% MeOH; thể tích bơm mẫu 100µl; tốc độ dịng 1,2 ml/phút và thay đổi pH lần lượt các giá trị từ 7,0 đến 9,0 với bước nhảy là 0,5. Kết quả thực nghiệm cho thấy khi sử dụng phương pháp đẳng dịng thì AsB và As3+ khơng tách được khỏi nhau. Ở các