CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU VÀ KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM
2.1.1. Phương phỏp nghiờn cứu
Để xỏc định cụng thức phõn tử của cỏc phức chất tổng hợp được trong luận
văn này, chỳng tụi sử dụng phương phỏp phõn tớch hàm lượng kim loại trong phức chất và phương phỏp phổ khối lượng.
Cấu tạo của cỏc phức chất và cỏch phối trớ của cỏc phối tử tổng hợp được
nghiờn cứu bằng cỏch sử dụng cỏc phương phỏp phổ hiện đại như: phổ hấp thụ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H và 13C, phổ hấp thụ electron.
Khả năng khỏng khuẩn, khỏng nấm của cỏc phối tử và phức chất đều được
nghiờn cứu và đỏnh giỏ qua chỉ số IC50.
2.1.2. Húa chất
Cỏc húa chất được sử dụng trong tổng hợp đều là cỏc húa chất tinh khiết. Một số húa chất dựng làm dung mụi hay chất chỉ thị được sử dụng đều là cỏc húa chất tinh khiết dựng trong phõn tớch của Trung Quốc. Cỏc dụng cụ thớ nghiệm và quỏ trỡnh tổng hợp được thực hiện tại phũng thớ nghiệm Húa sinh vơ cơ, Bộ mụn Húa vơ cơ, Khoa Húa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiờn, Đại học Quốc gia
Hà Nội.
Húa chất TT
Tờn húa chất Xuất xứ
1 Thiosemicacbazit Merk (Đức)
2 N(4) - phenyl thiosemicacbazit Merk (Đức)
3 Benzanđehit Merk (Đức)
4 ZnCl2 Trung Quốc
2.1.3. Kỹ thuật thực nghiệm 2.1.3.1. Cỏc điều kiện ghi phổ 2.1.3.1. Cỏc điều kiện ghi phổ
Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) của cỏc chất được ghi trờn mỏy quang phổ FR/IR 08101 của hóng Shimadzu trong khoảng từ 4000 - 400 cm-1, tại Viện Hoỏ Học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Mẫu được chế tạo theo phương phỏp ộp viờn với KBr.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H và 13C được ghi trờn mỏy Avance - 500 MHz (Bruker) ở 300 K, trong dung mụi DMSO - d6, tần số ghi phổ cộng hưởng từ proton là 500 MHz, tần số ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C ở 125 MHz, tại Viện Hoỏ học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
Phổ khối lượng (MS) được ghi trờn mỏy Varian MS 320 3Q - Ion Trap theo phương phỏp ESI tại Phũng cấu trỳc, Viện Hoỏ học, Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Dung mụi được sử dụng là DMF, điều kiện ghi mẫu: vựng đo m/z : 50 - 2000; ỏp suất phun mự 30 psi; tốc độ khớ làm khơ 8 lit/ph; nhiệt độ làm khụ 325oC; tốc độ khớ 0,4 ml/ph; chế độ đo possitive.
Phổ hấp thụ electron UV-Vis của chất được ghi trờn thiết bị đo phổ hấp thụ
UV-Vis -NIR tại viện Vật liệu - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Mẫu được chụp ở dạng bột mịn.
Hoạt tớnh sinh học của cỏc hợp chất được thử tại Phũng thử hoạt tớnh sinh
học, Viện Húa học, Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.1.3.2. Xỏc định hàm lượng kim loại trong phức chất
Để xỏc định hàm lượng ion kim loại trong cỏc phức chất chỳng tụi sử dụng
phương phỏp chuẩn độ complexon.
a. Phỏ mẫu phức kẽm hoặc đồng.
Cõn chớnh xỏc một lượng mo gam mẫu trong khoảng 0,03 ữ 0,05 gam, chuyển vào bỡnh Kendan. Thấm ướt mẫu bằng vài giọt H2SO4 đặc rồi đun trờn bếp
điện cho tới khi mẫu tan hết. Để nguội một ớt, rồi nhỏ vào đú 2 ml dung dịch H2O2 30%, tiếp tục đun cho tới khi cú khúi trắng thoỏt ra. Lặp lại cụng đoạn như vậy cho
tới khi thu được dung dịch trong suốt cú màu vàng trắng đối với phức của Zn(II),
màu xanh nhạt đối với phức của Cu(II), để nguội dung dịch thu được, trước khi tiến hành xỏc định hàm lượng ion kim loại trong phức chất như dưới đõy.
b. Xỏc định hàm lượng kẽm trong phức chất
Để nguội dung dịch thu được, sau đú chuyển vào bỡnh định mức 50ml. Hỳt
10ml dung dịch Zn(II) vào bỡnh nún 250ml thờm ớt chỉ thị murexit, điều chỉnh mụi
trường bằng dung dịch NH3 loóng tới khi pH = 8 (dung dịch cú màu vàng nhạt) rồi chuẩn độ bằng EDTA nồng độ C mol/l tới khi dung dịch chuyển sang màu tớm (hết V ml EDTA). Hàm lượng Zn(II) trong mẫu được tớnh theo cơng thức sau:
c. Xỏc định hàm lượng đồng trong phức chất
Để nguội dung dịch thu được, sau đú chuyển vào bỡnh định mức 50ml. Hỳt
10ml dung dịch Cu(II) vào bỡnh nún 250ml thờm ớt chỉ thị murexit, điều chỉnh mụi
trường bằng dung dịch NH3 loóng tới khi pH = 8 (dung dịch cú màu vàng nhạt) rồi chuẩn độ bằng EDTA nồng độ C mol/l tới khi dung dịch chuyển sang màu tớm (hết V ml EDTA). Hàm lượng Cu(II) trong mẫu được tớnh theo cơng thức sau:
% mC u=
V x C x 6 4 5 0 1 0
1 0 0 0 x mo x 100 %
2.1.3.3. Thăm dũ khả năng khỏng khuẩn, khỏng nấm của cỏc phối tử và cỏc phức chất
Hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trờn phương phỏp pha loóng đa nồng độ. Đõy là phương phỏp thử nhằm đỏnh giỏ mức độ khỏng vi
(50% inhibitor concentration - nồng độ ức chế 50%). Cỏc chủng vi sinh vật kiểm định gồm cỏc vi khuẩn và nấm kiểm định gõy bệnh ở người:
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường khụng gõy bệnh.
- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gõy mủ cỏc vết thương, vết bỏng,
gõy viờm họng, nhiễm trựng cú mủ trờn da và cỏc cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lờn men cú ớch, thường cú mặt trong hệ tiờu hoỏ của người và động vật.
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gõy một số bệnh về đường tiờu hoỏ như viờm dạ dày, viờm đại tràng, viờm ruột, viờm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gõy nhiễm
trựng huyết, cỏc nhiễm trựng ở da và niờm mạc, gõy viờm đường tiết niệu, viờm
màng nóo, màng trong tim, viờm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gõy bệnh thương hàn, nhiễm trựng
đường ruột ở người và động vật.
- Candida albicans: là nấm men, thường gõy bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và cỏc bệnh
phụ khoa.
Mụi trường nuụi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm.
Mẫu được pha trong DMSO (Đimethyl sulfoxide) với cỏc nồng độ 128; 32;
8; 2; 0,5 àg/ml. Cỏc dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 cfu/ml khi tiến hành thử. Sau đú lấy 10 àl dung dịch mẫu thử theo cỏc nồng độ đó được pha
loóng, thờm 200 àl dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ 37oC trong 24 giờ.
Giỏ trị IC50 được tớnh tốn dựa trờn số liệu đo độ đục của mụi trường nuụi