1.3. KỸ THUẬT LAI ĐIỂM
1.3.2. Phƣơng pháp đánh dấu đầu dò
Đầu dị có thể đƣợc sản xuất số lƣợng lớn bằng cách nhân dòng trong tế bào vật chủ gọi là đầu dị nhân dịng hoặc có thể đƣợc tổng hợp hóa học. Các phƣơng pháp đánh dấu đầu dị bao gồm đánh dấu DNA sợi đơn, DNA sợi kép và RNA sợi đơn. Trong quá trình đánh dấu, các nucleotide đã gắn với các chất đánh dấu nhƣ biotin, digoxigenin hay fluorescence đƣợc sử dụng thay thế hoặc kết hợp với các nucleotide bình thƣờng khác. Có hai phƣơng pháp đánh dấu đầu dò DNA [58].
Đánh dấu ở đầu tận cùng: Phƣơng pháp này có thể sử dụng enzyme polynucleotide
kinase để thêm một nhóm đã đƣợc đánh dấu vào một hoặc một vài nucleotide tận cùng. Chất đánh dấu thƣờng ở dạng 32P tại vị trí γ-phosphate của ATP và hoạt tính của polynucleotide kinase sẽ thực hiện phản ứng chuyển nhóm phosphate sang đầu 5’ của các phân tử axit nucleic. Phƣơng pháp này có thể sử dụng để đánh dấu oligonucleotide dạng sợi đơn và phân tử DNA dạng sợi đôi.
Đánh dấu thông qua phản ứng tổng hợp DNA in vitro thƣờng đƣợc thực hiện theo
Phương pháp đánh dấu bằng mồi ngẫu nhiên: Đầu dị đƣợc biến tính nhiệt để làm
khn cho DNA polymerase sử dụng dNTP đánh dấu và các mồi là các oligonucleotide (thƣờng là hexa hoặc octanucleotide).
Phương pháp dịch chuyển điểm đứt: DNase I sẽ cắt phân tử DNA ở nhiều vị trí
tạo những điểm đứt phân bố một cách ngẫu nhiên trên hai mạch. Từ những điểm đứt này, DNA polymerase I sẽ sử dụng dNTPs đánh dấu để sửa chữa. Kết quả cuối cùng DNA đƣợc đánh dấu trên khắp chiều dài phân tử.
Phương pháp đánh dấu nhờ PCR có hai cách thực hiện: (1) bổ sung một loại
nucleotide đánh dấu trong quá trình tổng hợp đầu dị; (2) sử dụng mồi có gắn nhóm đánh dấu ở đầu 5'. Cách thứ nhất cho tín hiệu tốt hơn vì chất đánh dấu có mặt dọc theo đầu dị. Phƣơng pháp đánh dấu PCR có lợi thế đặc biệt so với các phƣơng pháp khác. Đầu dị đƣợc tạo ra một cách nhanh chóng với kích thƣớc nằm trong phạm vi rộng; có thể thiết kế đầu dị từ bất cứ vùng gen nào quan tâm; chỉ cần lƣợng nhỏ khuôn DNA cho phản ứng tổng hợp. Phƣơng pháp này có thể áp dụng cho cả đầu dò sợi đơn (sử dụng một mồi) và sợi kép (sử dụng một cặp mồi).
Hình 1.7. Phƣơng pháp đánh dấu thông qua phản ứng tổng hợp DNA in vitro [16, 17].
Chất đánh dấu đầu dị có thể dùng chất đánh dấu phóng xạ sử dụng các đồng vị phóng xạ (32P, 33P, 35S, 3H, 14C, 125I). Hiện nay chúng ít đƣợc sử dụng bởi một số hạn chế
nhƣ chu kỳ bán rã ngắn (chu kỳ bán rã của 32P là 14,3 ngày) do đó phải lặp lại bƣớc đánh dấu đầu dò khi tiến hành thí nghiệm lai trong thời gian dài; nguy hiểm cho ngƣời sử dụng; u cầu nghiêm ngặt cho phịng thí nghiệm và cá nhân sử dụng cũng nhƣ việc xử lý chất thải. Chất đánh dấu khơng phóng xạ hiện nay đƣợc dùng chủ yếu do có độ an tồn, độ bền cao, đánh dấu tốt, có thể phát hiện tại chỗ và phát hiện nhanh chóng. Chất đánh dấu khơng phóng xạ có hai loại [58]:
Hệ thống đánh dấu trực tiếp: chất đánh dấu đƣợc phát hiện trực tiếp. Phổ biến nhất
là các enzyme nhƣ alkaline phosphatase hay horseradish perosidase, các chất huỳnh quang nhƣ fluorescence hay rhodamin.
Hệ thống đánh dấu gián tiếp: chất đánh dấu đầu dị (gọi là nhóm báo cáo) khơng
đƣợc phát hiện trực tiếp mà phải thông qua liên kết với một nhóm phát tín hiệu (gọi là nhóm chỉ thị). Nhóm chỉ thị có ái lực liên kết cao với nhóm báo cáo (nhờ phần ái lực). Sự phát hiện axit nucleic trong hệ thống gián tiếp bao gồm ba phản ứng: (i) đầu dò đã đƣợc đánh dấu (mang nhóm báo cáo) lai với phân tử đích; (ii) nhóm báo cáo gắn vào đầu dị liên kết với nhóm chỉ thị; (iii) nhóm chỉ thị phát tín hiệu (nhờ liên kết với nhóm báo cáo) (Hình 1.8).
Hình 1.8. Hệ thống đánh dấu gián tiếp [58].
Phổ biến nhất trong hệ thống này là hệ thống biotin (vitamin H). Trong đó, biotin đóng vai trị là nhóm báo cáo liên kết với nhóm chỉ thị streptavidin alkaline phosphatase (phần ái lực là streptavidin-một protein có nguồn gốc từ vi khuẩn
Streptomyces avidinii). Tƣơng tác giữa biotin và streptavidin là tƣơng tác sinh học
không cộng hóa trị mạnh nhất đƣợc biết đến trong tự nhiên (hằng số phân ly Kd=10-15). Đầu dị gắn biotin có thể đƣợc chuẩn bị dễ dàng với nucleotide đánh dấu biotin nhƣ biotin-11-dUTP hoặc biotin-16-dUTP.
1.3.3. Một số ứng dụng của kỹ thuật lai điểm
Trong phân tích axit nucleic, ứng dụng phổ biến của lai điểm là phân biệt sự sai khác 1 nucleotide giữa các allen nhờ đầu dò đặc hiệu [58]. Đầu dò đƣợc thiết kế trong vùng có vị trí nucleotide biến đổi và đặc hiệu với phân tử đích [58]. Đối với nghiên cứu xác định và nhân giống cây trồng, lai điểm là một trong những kỹ thuật phù hợp với phân tích các đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) [56].
Shirasawa và cs. (2006) sử dụng các đầu dò đặc hiệu để tiến hành lai điểm kiểm tra 100 gen trên các cây lúa có SNP [57]. Kiểu gen của 43 cây lúa đƣợc nhận biết và phân biệt với nhau dựa vào sự khác biệt ở 8 vị trí SNP. Kết quả của nghiên cứu cho thấy những ƣu thế của lai điểm: tính chính xác cao, đơn giản và hiệu quả khi phân tích SNP trên số lƣợng mẫu lớn [57].
Sự kết hợp giữa kỹ thuật MSP và kỹ thuật lai đã đƣợc nhiều nghiên cứu sử dụng nhằm phân tích sự methyl hóa DNA [10, 21]. Trong nghiên cứu của Raad và cs. (2001), nhóm tác giả đánh dấu sản phẩm MSP với fluorescence tại đầu 3’ và lai với một loạt đầu dò. Mƣời hai đầu dò đƣợc thiết kế để khảo sát tình trạng methyl hóa 15 vị trí CpG trong exon đầu tiên của gen ERα và chia thành các cặp. Mỗi cặp đầu dị có khả năng phân biệt allen bị methyl hóa và allen khơng bị methyl hóa tại 2 đến 4 vị trí CpG của trình tự đích. Nhờ đó, nhóm tác giả tạo ra một bản đồ bao gồm các vị trí CpG bị methyl hóa trong dịng tế bào ung thƣ vú, mẫu ung thƣ vú và mẫu mơ bình thƣờng [21]. Nhóm tác giả Pearlly và cs. (2003) cũng áp dụng phƣơng pháp thiết kế đầu dò trên để tiến hành khảo sát tình trạng methyl hóa đảo CpG gen RASSF1A. Từ các dữ liệu thu đƣợc, nghiên cứu chỉ ra sự phân bố vị trí CpG bị methyl hóa xảy ra từ exon đầu tiên tới vùng promoter trong mẫu ung thƣ vú. Tuy nhiên, trong các mơ vú bình thƣờng, các vị trí methyl hóa này chỉ quan sát đƣợc ở exon đầu tiên và không quan sát đƣợc ở vùng promoter [47]. Trong khi đó, Cle´ment và Benhattar (2005) sử dụng các đầu dò đánh dấu digoxigenin bổ sung với trình tự DNA đƣợc khuếch đại nhờ cặp mồi khơng có CpG của phản ứng PCR. Mỗi đầu dị sẽ xác định trình tự DNA bị methyl hóa hoặc khơng bị methyl hóa. Để xây dựng đối chứng cho thí nghiệm lai điểm, hai tác giả đã trộn khuôn DNA bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa theo tỷ lệ (0%, 20%, 50%, 100%), tiến hành xử lý bisulfite rồi khuếch đại bằng PCR. Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc sử dụng cho kỹ thuật lai điểm với hai loại đầu dị. Cƣờng độ tín hiệu của các chấm trên trở thành đối chứng để định lƣợng tỷ lệ bị methyl hóa cho các mẫu phân tích khi lai với hai loại đầu dò. Áp dụng đối chứng này, hai tác giả định lƣợng tỷ lệ methyl
hóa trên 3 gen hTERT, APC, và p16 đối với 2 mẫu mơ bình thƣờng và 10 mẫu ung thƣ thực quản [10].
Dựa trên phƣơng pháp sử dụng đầu dò đánh dấu trong nghiên cứu của Cle´ment và Benhattar (2005), Phịng Thí nghiệm Sinh Y đã kết hợp kỹ thuật MSP và kỹ thuật lai điểm dot blot nhằm phân tích sự methyl hóa DNA. Phịng Thí nghiệm Sinh Y đã thiết kế hai plasmid pMeG200 và pMeR200 lần lƣợt mang trình tự đầu dị (G200 và R200) đặc hiệu với trình tự GSTP1 và RASSF1A bị methyl hóa sử dụng cho kỹ thuật lai điểm. Trình tự hai đầu dị này nằm trong vùng giàu CpG, giữa hai mồi MSP khuếch đại trình tự bị methyl hóa. Nhờ đó, đầu dị chỉ phát hiện trình tự bị methyl hóa và khơng cho tín hiệu với các sản phẩm phụ khác (sản phẩm không đặc hiệu hoặc dimer). Do trình tự bị methyl hóa và trình tự khơng bị methyl hóa có sự tƣơng đồng với nhau, sai khác nhau ở 5-6 vị trí CpG nên chúng tơi cần phải xác định điều kiện lai điểm để đầu dị chỉ lai với trình tự bị methyl hóa (Hình 1.9). Nghiên cứu trƣớc mới dừng lại ở kết quả tối ƣu đƣợc điều kiện lai điểm của đầu dò G200 cho phép phát hiện đặc hiệu trình tự GSTP1 bị methyl hóa, phân biệt với trình tự GSTP1 khơng bị methyl hóa có sử dụng formamide trong dung dịch đệm lai. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi sẽ tối ƣu điều kiện lai điểm của đầu dị G200 khơng sử dụng formamide và tiếp tục hoàn thiện điều kiện lai điểm cho đầu dị R200.
.
Hình 1.9. Mức độ tƣơng đồng giữa trinh tự bị methyl hóa và trình tự khơng bị methyl hóa với
đầu dị đặc hiệu. (A) Mức độ tƣơng đồng trình tự GSTP1 bị methyl hóa (MeG) và trình tự
GSTP1 khơng bị methyl hóa (UnG) với đầu dị G200. Vùng màu xám: 6 vị trí nucleotide khác
nhau giữa MeG và UnG. (B) Mức độ tƣơng đồng trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) và
trình tự RASSF1A khơng bị methyl hóa (UnR) với đầu dò R200. Vùng màu xám: 5 vị trí
Nhƣ đã trình bày, sự methyl hóa GSTP1 và RASSF1A đều có thể quan sát đƣợc
ở ung thƣ tuyến tiền liệt và ung thƣ vú. Cụ thể, methyl hóa GSTP1 có mối liên hệ với các giai đoạn khác nhau của ung thƣ tuyến tiền liệt, có thể phân biệt ung thƣ tuyến tiền liệt với các bệnh liên quan tới tuyến tiền liệt. Sự methyl hóa GSTP1 đƣợc xác định thơng qua các dịch cơ thể (huyết thanh, huyết tƣơng, nƣớc tiểu) và có độ đặc hiệu cao hơn so với xét nghiệm PSA trong huyết thanh [64]. Trong khi đó, RASSF1A có mối liên hệ với các đặc điểm xâm nhập của khối u nên các khối u xảy ra sự methyl hóa
RASSF1A có mối tƣơng quan với độ Gleason và PSA [23]. Đối với ung thƣ vú, các
nghiên cứu những năm 1990 cho thấy, đảo CpG của promoter GSTP1 khơng bị methyl hóa ở mơ vú bình thƣờng nhƣng bị methyl hóa q mức ở các mơ ung thƣ vú đồng thời có mối liên hệ với mức giảm biểu hiện của protein GSTP1 [45]. Sự methyl hóa quá mức promoter của RASSF1A là một sự kiện xảy ra sớm trong quá trình phát triển ung thƣ vú, đƣợc duy trì ổn định ở tất cả các giai đoạn trong quá trình tiến triển ung thƣ vú [20]. Hơn nữa, methyl hóa RASSF1A xuất hiện có mối tƣơng quan với tiên lƣợng xấu và có thể trở thành một chỉ thị sinh học có giá trị cho ung thƣ vú [20]. Do đó, sự methyl hóa của hai gen này đƣợc chúng tôi lựa chọn để nghiên cứu trong luận văn.
Các nghiên cứu không chỉ sử dụng mẫu mơ ung thƣ mà cịn lựa chọn các mẫu đối chứng để phân tích sự methyl hóa. Nghiên cứu của Phuong và cs. (2015) sử dụng 20 mẫu mơ vú bình thƣờng phân tích cùng 95 mẫu mơ của bệnh nhân ung thƣ vú ngƣời Việt Nam [49]. Hoque và cs. (2006) sử dụng mẫu đối chứng là 76 mẫu máu [29]. Theo Massie và cs. (2017), mẫu đối chứng phù hợp nhất để phân tích sự methyl hóa đặc hiệu khối u là mẫu mơ bình thƣờng nằm cùng cơ quan với khối u. Ở nhiều loại ung thƣ, sự thay đổi methyl hóa có thể quan sát đƣợc ở mơ liền kề. Vì thế, mơ liền kề sẽ là một lựa chọn thích hợp để so sánh những biến đổi di truyền ngoại gen với mô ung thƣ [42]. Cho và cs. (2010) đã phân tích sự methyl hóa các gen trên cặp mẫu mô ung thƣ và mô liền kề từ 40 bệnh nhân ung thƣ vú [8]. Trong luận văn này, ngồi việc phân tích sự methyl hóa promoter GSTP1 trên 10 mẫu mô đúc ung thƣ tuyến tiền liệt, chúng tơi
cũng phân tích sự methyl hóa promoter GSTP1 và RASSF1A trên 49 cặp mẫu mơ ung thƣ và mô liền kề từ bệnh nhân ung thƣ vú bằng kỹ thuật MSP. Từ đó, chúng tơi khảo sát đƣợc tình trạng methyl hóa của hai gen trên hai loại mẫu này.
Từ kết quả MSP thu đƣợc, chúng tôi sẽ phát hiện một số sản phẩm MSP dƣơng tính với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình tự GSTP1 bị methyl hóa bằng lai điểm, sử dụng điều kiện tối ƣu của đầu dị G200. Vì vậy, luận văn “Ứng dụng kỹ thuật lai
điểm để phát hiện methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thƣ vú và ung thƣ tuyến tiền liệt” đƣợc thực hiện với các mục tiêu bao gồm: (1) Tối ƣu điều
kiện lai điểm của đầu dị G200 và R200; (2) Khảo sát tình trạng methyl hóa promoter
GSTP1 và RASSF1A trên 49 cặp mẫu mô ung thƣ vú và mẫu mơ liền kề; tình trạng methyl hóa promoter GSTP1 trên 10 mẫu đúc ung thƣ tuyến tiền liệt bằng kỹ thuật
MSP; (3) Phát hiện một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm dƣơng tính với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình tự GSTP1 bị methyl hóa nhờ kỹ thuật lai điểm.
Chƣơng 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP