3.2. PHÂN TÍCH SỰ METHYL HÓA PROMOTER GEN GSTP1 VÀ RASSF1A
3.2.3. Xác định sự methyl hóa promoter của hai gen GSTP1 và RASSF1A trên các
bệnh phẩm
Sử dụng điều kiện đã tối ƣu nhƣ Bảng 2.4 và Bảng 2.5 cho các phản ứng MSP [62], chúng tôi tiến hành xác định sự methyl hóa promoter GSTP1 với 10 mẫu mơ đúc từ bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt. Kết quả MSP đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 8% (Hình 3.8). Băng 149 bp đƣợc phát hiện ở 10 mẫu với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình tự khơng bị methyl hóa. Băng 155 bp chỉ phát hiện ở 6/10 mẫu đối với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình tự bị methyl hóa. Với số lƣợng mẫu tuyến tiền liệt hạn chế, chúng tôi chƣa phân tích mối tƣơng quan của sự methyl hóa GSTP1
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter GSTP1 sử dụng
các mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt (T1-T10). Giếng m là băng đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa (155 bp) và giếng u là băng đặc hiệu cho GSTP1 khơng bị methyl hóa (149 bp). Giếng (-): Đối chứng âm khơng có khn DNA. Giếng M: Thang chuẩn 100 bp (Fermentas).
Tƣơng tự nhƣ trên, sự methyl hóa promoter GSTP1 của 49 cặp mẫu mơ ung thƣ vú và mẫu mơ liền kề đƣợc phân tích bằng MSP, kết quả đƣợc minh họa trên Hình 3.9. Băng 149 bp khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu trình tự GSTP1 khơng bị methyl hóa
xuất hiện ở tất cả 49 cặp mẫu bệnh phẩm. Băng 155 bp khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu trình tự GSTP1 bị methyl hóa xuất hiện ở 28/49 mẫu mô ung thƣ và 15/49 mẫu
mô liền kề. Kết quả này tƣơng ứng tỉ lệ phát hiện methyl hóa promoter GSTP1 ở mẫu mô ung thƣ và mẫu mô liền kề lần lƣợt là 57,14% và 30,61%. Một số nghiên cứu phát hiện tỷ lệ GSTP1 bị methyl hóa ở ung thƣ vú nằm trong khoảng 13% - 38,9% [37, 46, 52]. Trong nghiên cứu này của chúng tơi, tỷ lệ methyl hóa promoter GSTP1 ở mẫu mô ung thƣ đạt 57,14%. Tham khảo nghiên cứu công bố của Phuong và cs. (2015) trên 95 mẫu ung thƣ vú ngƣời Việt Nam, nhóm tác giả phát hiện tỷ lệ methyl hóa GSTP1 là 43,2% [49]. Nghiên cứu của Yamamoto và cs. (2012) đã phát hiện tỷ lệ methyl hóa
GSTP1 đạt 48% trên 58 bệnh nhân ung thƣ vú ngƣời Nhật Bản [65]. Theo phân tích
tổng hợp của Fang và cs. (2015), có mối liên hệ mang ý nghĩa thống kê giữa sự methyl hóa promoter GSTP1 với ung thƣ vú ở cả ngƣời da trắng và ngƣời châu Á, trong đó
Chi bình phƣơng, tỷ lệ methyl hóa promoter GSTP1 trên mẫu mô ung thƣ và mẫu mô
liền kề khác nhau có ý nghĩa thống kê (p = 0,0146). Do đó, methyl hóa promoter
GSTP1 có thể phân biệt đƣợc giữa mẫu mơ ung thƣ vú và mẫu mơ liền kề.
Hình 3.9. Kết quả điện di minh họa sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter gen
GSTP1 sử dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú. VU: Các mẫu mô ung thƣ. VL: Các mẫu mô
liền kề. Giếng m là băng đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa (155 bp), giếng u là băng đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa (149 bp). Giếng (-): Đối chứng âm khơng có khn DNA.
Giếng M: Thang chuẩn 100 bp (Fermentas).
Sự methyl hóa promoter RASSF1A đƣợc phân tích bằng kỹ thuật MSP với cặp
mồi khuếch đại trình tự bị methyl hóa và cặp mồi khuếch đại trình tự khơng bị methyl hóa nhƣ thành phần và điều kiện trong Bảng 2.6 và Bảng 2.7. Kết quả phân tích sự methyl hóa ở 49 cặp mẫu bệnh phẩm đƣợc minh họa trên Hình 3.10. Băng 135 bp đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại trình tự khơng bị methyl hóa đƣợc phát hiện ở tất cả các mẫu bệnh phẩm. Tuy nhiên, băng 170 bp đặc hiệu với cặp mồi khuếch đại trình tự bị methyl hóa chỉ xuất hiện ở 29/49 mẫu mơ ung thƣ và 20/49 mẫu mô liền kề. Nhƣ vậy, tỉ lệ phát hiện methyl hóa promoter RASSF1A ở mẫu mơ ung thƣ và mẫu mô liền kề lần lƣợt là 59,18% và 40,82%. Kết quả tỷ lệ methyl hóa promoter RASSF1A của chúng tôi thấp hơn tỷ lệ phát hiện trong nghiên cứu Karray-Chouayekh và cs. (2010) [32], Cho và cs. (2010) [8] nhƣng cao hơn so với 2 nghiên cứu ở bệnh nhân ngƣời Australia của Gobel và cs. (2011) [22] và Fiegl (2005) [19]. Theo phân tích tổng hợp 8 nghiên cứu
của Jiang và cs. (2012), tỷ lệ phát hiện sự methyl hóa promoter RASSF1A trong ung thƣ vú trong khoảng 19,6% - 87% [31]. Khi xét các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật MSP, 59,18% mẫu mơ ung thƣ có RASSF1A bị methyl hóa của chúng tơi gần sát với tỷ lệ
57% từ kết quả của Kioulafa và cs. (2009) trên 93 bệnh nhân ngƣời Hy Lạp, hoặc tỷ lệ 63% từ kết quả của Sharma và cs. (2009) trên 100 bệnh nhân ngƣời Ấn Độ [33, 54]. Trong khi đó, Karray-Chouayekh và cs. (2010) phân tích 78 bệnh nhân ngƣời Tunisian thu đƣợc tỷ lệ là 87%, cao hơn hẳn so với các nghiên cứu khác cùng sử dụng kỹ thuật này [32]. Nhóm tác giả cho rằng, hiện tƣợng RASSF1A bị methyl hóa thƣờng xuyên
xảy ra đối với bệnh nhân ngƣời Tunisian [32]. Hơn nữa, ba nghiên cứu Gobel và cs. (2011), Fiegl (2005) và Buhmeida và cs. (2011) đều sử dụng kỹ thuật MSP định lƣợng (qMSP) để phân tích cùng một vùng promter gen RASSF1A. Hai nghiên cứu Gobel và cs. (2011), Fiegl (2005) trên ngƣời bệnh Australia thu đƣợc tỷ lệ gần xấp xỉ nhau lần lƣợt là 21,8% và 19,6%, trong khi kết quả nghiên cứu của Buhmeida và cs. (2011) là 65% đối với ngƣời Ả-rập [7, 19, 22]. Rõ ràng, tỷ lệ methyl hóa promoter RASSF1A
thay đổi nhiều ở các nghiên cứu độc lập có thể đƣợc giải thích do phụ thuộc vào chủng tộc [20, 26, 31]. Khơng giống nhƣ sự methyl hóa promoter GSTP1, tỷ lệ bị methyl hóa promoter RASSF1A trên mẫu mô ung thƣ và mẫu mô liền kề trong nghiên cứu của chúng tơi khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,1060). Trong nghiên cứu của Cho và cs. (2010), nhóm tác giả sử dụng MSP định lƣợng (qMSP) để phân tích sự methyl hóa q mức của 8 gen ức chế khối u trong đó có RASSF1A trên mẫu ung thƣ ống dẫn sữa xâm nhập, cặp mẫu mô ung thƣ-mẫu mô liền kề và mẫu máu từ 40 bệnh nhân. Kết quả của nhóm tác giả cho tỷ lệ methyl hóa của RASSF1A trên mẫu mơ ung thƣ và mẫu mô liền kề cao tƣơng đƣơng nhau (82,5% trên mẫu mô ung thƣ và 85,2% trên mẫu mô liền kề) [8].
Hình 3.10. Kết quả điện di minh họa sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter
RASSF1A sử dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú. VU: Các mẫu mô ung thƣ. VL: Các mẫu
mô liền kề. Giếng m là băng đặc hiệu cho RASSF1A bị methyl hóa (170 bp) và giếng u là băng
đặc hiệu cho RASSF1A khơng bị methyl hóa (135 bp). Giếng (-): Đối chứng âm khơng có
khn DNA. Giếng M: Thang chuẩn 100 bp (Fermentas).
Các kết quả xác định sự methyl hóa hai gen GSTP1 và RASSF1A trên các cặp
mẫu mô ung thƣ và mơ liền kề đƣợc tóm tắt trong Bảng 3.5. Sự phát hiện tỷ lệ methyl hóa promoter gen RASSF1A trên mẫu mô liền kề không thống nhất ở các nghiên cứu khác. Nghiên cứu trên 36 mẫu bệnh nhân ung thƣ vú của Li và cs. (2008) khơng phát hiện đƣợc sự methyl hóa promoter RASSF1A ở các mẫu mô liền kề cách khối u 5 cm [38]. Trong khi đó, nghiên cứu của Cho và cs. (2010) phát hiện tỷ lệ methyl hóa promoter RASSF1A ở mẫu mô liền kề là 85,2%. Nhóm tác giả cho rằng sự phát hiện
methyl hóa ở các mẫu mô liền kề là do lẫn các tế bào khối u hoặc các tế bào bị tổn thƣơng [8]. Trong nghiên cứu của Yan và cs. (2006), sự thay đổi methyl hóa ở ung thƣ vú có thể tìm thấy trong khoảng 4 cm tính từ khối u ban đầu [66]. Theo Hoque và cs. (2009), sự methyl hóa promoter trong các tế bào sinh dƣỡng đóng vai trị quan trọng trong việc thiết lập vi mơi trƣờng bất thƣờng, góp phần vào sự tiến triển ung thƣ [29]. Sự methyl hóa phát hiện ở mẫu mơ liền kề đƣợc coi là nguyên nhân dẫn tới tính phức tạp trong ung thƣ vú và cũng có thể đóng vai trị dự đốn nguy cơ ung thƣ [8, 20].
Bảng 3.5. Tỷ lệ methyl hóa hai gen GSTP1 và RASSF1A trong ung thƣ vú
Tên gen GSTP1 RASSF1A
Loại mẫu Ung thƣ Liền kề p-value Ung thƣ Liền kề p-value
Số mẫu bị methyl hóa 28 15
0,0146*
29 20
0,1060
Số mẫu khơng bị methyl hóa 21 34 20 29
Tỷ lệ methyl hóa 57,14% 30,61% 59,18% 40,82%
3.2.4. Mối liên hệ giữa sự methyl hóa và các thơng số sinh học
Kết hợp kết quả mô bệnh học của các mẫu bệnh phẩm với kết quả methyl hóa của hai gen, bằng phƣơng pháp thống kê sinh học, chúng tôi đã khảo sát mối tƣơng quan giữa sự methyl hóa promoter gen GSTP1 và RASSF1A với thơng số sinh học bao gồm: loại ung thƣ, tình trạng di căn của hạch, độ mô học và độ tuổi. Kết quả đƣợc trình bày cụ thể trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Mối liên hệ giữa sự methyl hóa promoter hai gen GSTP1 và RASSF1A với các thông số sinh học của bệnh nhân ung thƣ vú. n: số mẫu; OXN: Ống dẫn sữa xâm nhập; *: kết quả có ý nghĩa thống kê (p-value < 0,05)
TÊN GEN GSTP1 RASSF1A
LOẠI MẪU Ung thƣ Liền kề Ung thƣ Liền kề
LOẠI UNG THƢ Thể OXN (n = 42) 21 12 26 18 Loại khác (n = 7) 7 3 3 2 p-value 0,0151* 0,6598 0,4221 0,6848 HẠCH Không di căn (n = 28) 12 8 18 12 Di căn (n = 15) 11 4 7 5 p-value 0,1074 1,0000 0,3378 0,7448 ĐỘ Độ 1+2 (n = 35) 18 10 21 15 Độ 3 (n = 5) 1 1 3 1 p-value 0,3451 1,0000 1,0000 0,6309 TUỔI < 50 tuổi (n = 17) 8 5 10 7 ≥ 50 tuổi (n = 32) 20 10 19 13 p-value 0,3697 1,0000 1,0000 1,0000
Chúng tôi nhận thấy, mối liên hệ giữa methyl hóa gen GSTP1 với độ ung thƣ, tình trạng di căn của hạch và tuổi trong nghiên cứu này khơng có ý nghĩa thống kê. Sự methyl hóa gen GSTP1 trên các mẫu mơ ung thƣ chỉ có mối liên hệ với loại ung thƣ mang ý nghĩa thống kê (p = 0,0151). Trong nghiên cứu của Lee (2007) trên 124 mẫu bệnh phẩm, tỷ lệ phát hiện methyl hóa GSTP1 ở ung thƣ ống dẫn sữa xâm nhập (38,9%) cao hơn so với ung thƣ ống dẫn sữa tăng sản bất thƣờng (16,7%), ung thƣ ống dẫn sữa tại chỗ (36,7%) [37]. Vì vậy, tình trạng methyl hóa GSTP1 có thể là một chỉ thị đặc hiệu cho loại ung thƣ ống dẫn sữa xâm nhập. Điểm hạn chế trong nghiên cứu của
chúng tôi là số lƣợng mẫu nhỏ nên để khẳng định giả thiết trên, cần tiến hành trên số lƣợng mẫu lớn hơn. Từ các giá trị p-value trong Bảng 3.6, tình trạng methyl hóa promoter RASSF1A khơng có mối liên hệ với các thông số sinh học. Kết quả này tƣơng tự với nhiều công bố khác [26, 38]. Nghiên cứu Heba và cs. (2012), Li và cs. (2008) đều khơng tìm thấy mối liên hệ nào có ý nghĩa thống kê giữa tình trạng methyl hóa
RASSF1A với các thơng số nhƣ loại ung thƣ, độ ung thƣ, tình trạng di căn của hạch và
tuổi trên các mẫu mô ung thƣ vú [26, 38]. Điều này cho thấy sự methyl hóa RASSF1A là một thay đổi sớm ở mức độ phân tử trong quá trình sinh ung thƣ vú và đƣợc duy trì ở các giai đoạn sau của bệnh [38].
3.2.5. Kết quả lai điểm trên một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm
Trong các mẫu dƣơng tính với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình tự GSTP1 bị methyl hóa, chúng tơi chọn 8 sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú và 6 sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt để lai điểm với đầu dò G200 theo điều kiện lai điểm Bảng 3.1. Hai µl mỗi mẫu đƣợc dùng để chấm lên màng. Đồng thời 2 µl đầu dị B(+)G và đầu dị B(-)G cũng đƣợc chấm lên màng. Quy trình đƣợc thực hiện theo mục 2.2.8. Kết quả lai điểm đƣợc trình bày trên Hình 3.11.
Hình 3.11. Kết quả lai điểm trên một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú (A) và
ung thƣ tuyến tiền liệt (B). B(+)G, B(-)G: Đầu dị G200 có và khơng có biotin. VU, VL: Các mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú. T: Các mẫu bệnh phẩm tuyến tiền liệt.
Quan sát kết quả trên Hình 3.11, chúng tơi nhận thấy, B(+)G và B(-)G đều cho tín hiệu rõ nét. Cả 14 sản phẩm MSP đều cho tín hiệu lai rõ ràng tức là đã phát hiện
đƣợc sản phẩm có GSTP1 bị methyl hóa. Do đó, kỹ thuật lai điểm có thể thay thế đƣợc kĩ thuật điện di trong việc phát hiện sản phẩm MSP bị methyl hóa. Trong thời gian tới, chúng tôi sẽ tiếp tục áp dụng điều kiện lai điểm tối ƣu của đầu dò R200 trên các sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi đƣa ra một số kết luận nhƣ sau:
1. Điều kiện lai điểm sử dụng đầu dị G200 khơng có formamide, và điều kiện lai điểm sử dụng đầu dò R200 giúp phân biệt trình tự nucleotide bị methyl hóa và trình tự nucleotide khơng bị methyl hóa tại 4 ng và cho phép phát hiện 1 ng sản phẩm tinh sạch bị methyl hóa
2. Khảo sát đƣợc tình trạng methyl hóa của hai gen GSTP1 và RASSF1A bằng kỹ thuật MSP trên các mẫu bệnh phẩm cũng nhƣ mối liên hệ giữa sự methyl hóa với các thơng số sinh học
3. Đầu dò G200 đã phát hiện đƣợc sản phẩm có GSTP1 bị methyl hóa trong điều kiện lai điểm tối ƣu.
KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả có đƣợc, chúng tơi đƣa ra hƣớng nghiên cứu tiếp theo:
1. Áp dụng điều kiện lai điểm tối ƣu của đầu dò R200 trên sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm
2. Khảo sát tỷ lệ methyl hóa trên các mẫu bệnh phẩm của cả hai gen GSTP1 và RASSF1A bằng kỹ thuật lai điểm
3. Phát triển kỹ thuật lai điểm để có thể phát hiện cùng lúc sự methyl hóa của nhiều gen trên một màng lai.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Thu Trang (2014), Thiết kế đầu dò cho kỹ thuật lai điểm (Dot blot) để phát
hiện GSTP1 bị methyl hóa trong phản ứng khuếch đại đặc hiệu methyl (Methylation Specific PCR – MS-PCR), Khóa luận tốt nghiệp Đại học chính
quy, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
2. Đoàn Thị Hồng Vân (2014), Thiết kế đầu dò cho kỹ thuật lai điểm (Dot Blot) để
phát hiện RASSF1A bị methyl hóa trong phản ứng khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR), Khóa luận tốt nghiệp Đại học chính
quy, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Tiếng Anh
3. Agathanggelou A., Cooper N.W., Latif F. (2005), "Role of the Ras-Association Domain Family 1 tumor suppressor gene in human cancers", Cancer Research, 65, pp. 3497-3508.
4. Ausubel M.F., Brent R., Kingston E.R., Moore D.D., Seidman G.J., Smith A.J., Struhl K. (2003), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, Australia.
5. Barekati Z., Radpour R., Kohler C., Zhong X.Y. (2010), "Specificity of methylation assays in cancer research: a guideline for designing primers and probes", Obstetrics and Gynecology International, 2010(pp. 1-7.
6. Bonilla V.J., Srivatsa G.S. (2016), Handbook of analysis of oligonucleotides and related products, CRC Press, Florida.
7. Buhmeida A., Merdad A., El-Maghrabi J., Al-Thobaiti F., Ata M. (2011), "RASSF1A methylation is predictive of poor prognosis in female breast
cancer in a background of overall low methylation frequency", Anticancer Research, 31, pp. 2975-2981.
8. Cho Y.H., Wu H.-C., Terry B.M., Gonzalez K., Qu M., Dalay N., Santella M.R. (2010), "Aberrant promoter hypermethylation and genomic hypomethylation in tumor, adjacent normal tissues and blood from breast cancer patients",
Anticancer Research, 30, pp. 2489-2496.
9. Clark S.J., Statham A., Stirzaker C., Molloy P.L., Frommer M. (2006), "DNA methylation: bisulphite modification and analysis", Nature Protocols, 1(5),
pp. 2353-2364.
10. Clement G., Benhattar J. (2005), "A methylation sensitive dot blot assay (MS- DBA) for the quantitative analysis of DNA methylation in clinical samples",
Journal of Clinical Pathology, 58(2), pp. 155-158.
11. Costello F.J., Plass C. (2001), "Methylation matters", Journal of Medical Genetics, 38, pp. 285-303.
12. Crider K.S., Yang T.P., Berry R.J., Bailey L.B. (2012), "Folate and DNA methylation: a review of molecular mechanisms and the evidence for folate's role", Advances in Nutrition, 3(1), pp. 21-38.
13. Delpu Y., Cordelier P., Cho W.C., Torrisani J. (2013), "DNA methylation and cancer diagnosis", International Journal of Molecular Sciences, 14(7), pp.
15029-15058.
14. Doi A. et al. (2009), "Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts", Nature Genetics, 41(12), pp. 1350-1353.
15. Donninger H., Vos D.M., Clark J.G. (2007), "The RASSF1A tumor suppressor", Journal of Cell Science, 120(18), pp. 3163-3172.
16. Eisel D., Seth O., Grunewald-Janho S., Kruchen B. (2008), DIG Application Manual for Nonradioactive In Situ Hybridization, Roche Diagnostics GmbH,
Germany.
17. Eisel D., Seth O., Grunewald-Janho S., Kruchen B., Ruger B. (2008), DIG Application Manual for filter hybridization, Roche Diagnostics GmbH,