2.2.1. Nguyên liệu
Các cặp mẫu mô tƣơi (mẫu mô ung thƣ vú và mẫu mô liền kề) từ 49 bệnh nhân ung thƣ vú; mẫu mô đúc từ 10 bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt đƣợc cung cấp bởi Khoa Giải phẫu, Bệnh viện K từ tháng 2 năm 2012 đến tháng 12 năm 2013. Các mẫu mô liền kề đƣợc lấy cách khối u ung thƣ vú khoảng 3-5 cm. Mẫu bệnh phẩm đƣợc tách chiết DNA sau đó tiến hành xử lý với sodium bisulfite. DNA sau xử lý đƣợc dùng làm khuôn cho kỹ thuật MSP với cặp mồi đặc hiệu trình tự bị methyl hóa và trình tự khơng bị methyl hóa.
Dịng vi khuẩn E. coli JM109 (Promega) mang các plasmid tái tổ hợp sử dụng cho kỹ thuật lai điểm đƣợc trình bày cụ thể trong Bảng 2.1. Các dòng vi khuẩn này đƣợc cung cấp bởi Phịng Thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng cho kỹ thuật lai điểm
Tên plasmid Đoạn chèn Mục đích
pGEM155 Đoạn chèn GSTP1 bị methyl hóa kích
thƣớc 155 bp
Dùng làm khuôn cho phản ứng PCR nhằm tinh sạch sản phẩm mang trình tự gen bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa
pT149 Đoạn chèn GSTP1 không bị methyl
hóa kích thƣớc 149 bp
pRASS170 Đoạn chèn RASSF1A bị methyl hóa
kích thƣớc 170 bp
pRASS135 Đoạn chèn RASSF1A không bị methyl
hóa kích thƣớc 135 bp
pMeG200 Đoạn 45 bp chứa 6 CpG trong vùng
trình tự GSTP1 bị methyl hóa Dùng làm khuôn cho phản
ứng PCR tổng hợp đầu dị có và khơng có biotin
pMeR200 Đoạn 57 bp chứa 5 CpG trong vùng
trình tự RASSF1A bị methyl hóa 2.2.2. Hóa chất
dNTPs (Promega)
MgCl2 (Promega)
Đệm Taq polymerase 10x (chứa 15 mM MgCl2) (Sigma-Aldrich)
JumpStart Taq DNA polymerase 2,5 u/µl (Sigma-Aldrich)
Đệm DreamTaq polymerase 10x (20 mM MgCl2) (Fermentas)
DreamTaq DNA polymerase 5 u/µl (Fermentas)
Kit tách chiết: Wizard®SV Genomic DNA Purification System (Promega, A2360) và QIAamp® FFPE tissue (Qiagen, 56404)
Kit xử lý bisulfite: MethylEdge™ Bisulfite Conversion System (Promega, N1301) và EpiTect® Bisulfite (Qiagen, 59104)
Kit tinh sạch sản phẩm PCR: High pure PCR production purification (Roche)
Kit tách plasmid: High pure isolation plasmid (Roche)
Biotin-11-dUTP 1 mM (Fermentas)
Cơ chất cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega)
Màng nylon tích điện dƣơng (Nylon membrane, positively charged-Roche)
Tween 20 100% (Sigma-Aldrich)
Các dung dịch dùng cho quá trình lai điểm đƣợc trình bày trong Bảng 2.2
Các hóa chất thơng dụng khác đều đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Bảng 2.2. Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm
Dung dịch Thành phần
Đệm tiền lai/Đệm lai H1 SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%
Đệm rửa W1 SSC 6x; SDS 0,1%
Đệm rửa W2 SSC 2x; SDS 0,1%
Đệm rửa U1 Tris-HCl 0,1 M pH 7,5; NaCl 1,5 M
Đệm rửa U2 Tris-HCl 0,1 M pH 9,5; NaCl 0,1 M; MgCl2 0,05 M
SSC 1x NaCl 0,015 M; Natri citrate 0,15 M pH 7,0
Denhardt 1x Ficoll 400 0,02%; Polyvinylpyrrolidone 0,02%;
Bovine serum albumin 0,02%
Các cặp mồi
Cặp mồi M13 F/M13 R thiết kế dựa vào trình tự có trong vector pTZ57R/T (đƣợc gọi là cặp mồi của vector). Plasmid pMeG200 và pMeR200 đƣợc sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi của vector sẽ tạo các đầu dò G200 và R200 lần lƣợt có kích thƣớc 200 bp và 212 bp. Để thực hiện kỹ thuật MSP, phản ứng sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho trình tự bị methyl hóa và cặp mồi đặc hiệu cho trình tự khơng bị methyl hóa đã đƣợc tối ƣu trong nghiên cứu trƣớc đó [62]. Các cặp mồi đƣợc cung cấp bởi hãng IDT. Trình tự các mồi sử dụng và kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng đƣợc trình bày trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Trình tự mồi sử dụng cho nghiên cứu và kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng
Tên mồi Trình tự 5’-3’ Kích thƣớc
Tài liệu tham khảo
M13 F GTAAAACGACGGCCAGT 200 bp (khuôn là pMeG200),
212 bp (khuôn là pMeR200) Cung cấp bởi kit M13 R CGAGAAACAGCTATGAC GSTP-MeF TTCGGTTAGTTGCGCGGCGATTTC 210 bp [62] GSTP- MSP5R1 CGACGAAACTCCAACGAAAAC GSTP-MTF1 TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC 155 bp [62] GSTP- MSP5R1 CGACGAAACTCCAACGAAAAC GSTP-UN1F AGTTGTGTGGTGATTTTGGGGATA 194 bp [62] GSTP-UN1R CCAACAAAAACCTCACAACCTCCA GSTP-UMF GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTTG 149 bp [62] GSTP-UN1R CCAACAAAAACCTCACAACCTCCA RASSF1A- MeF GGTTTTGCGAGAGCGCGTTTA 170 bp [62] RASSF1A- MeR CAACGCTAACAAACGCGAACCGA RASSF1A- UM240F GGGGTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG 175 bp [62] RASSF1A- UM241R TAAACACTAACAAACACAAACCAAAC RASSF1A- UNF GAGAGTGTGTTTAGTTTTGTTT 135 bp [62] RASSF1A- UNR CCACAAAACAAACCCCAACTT
2.2.3. Thiết bị
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phịng Thí nghiệm Sinh Y và Phịng Sinh học phân tử, Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.