2.3. PHƢƠNG PHÁP
2.3.8. Phƣơng pháp lai điểm
Quá trình lai điểm đƣợc thực hiện theo các bƣớc cụ thể nhƣ sau:
Biến tính các sản phẩm PCR ở 900C trong 10 phút sau đó ngay lập tức để trên đá trong 5 phút
Chấm 2 µl/mẫu lên màng, để khơ màng trong 2 phút
Cố định DNA trên màng nylon tích điện dƣơng bằng UV: chiếu tia cực tím ở bƣớc sóng 254 nm trong 5 phút
Dung dịch đệm tiền lai đã để ở nhiệt độ lai trƣớc khi dùng. Chuyển màng sang đệm tiền lai. Ủ màng ở nhiệt độ lai trong 15 phút
Biến tính đầu dị: Bổ sung 14 µl đầu dị đã đánh dấu biotin-11-dUTP bằng phản ứng PCR vào 100 µl đệm lai. Ủ dung dịch có chứa đầu dị đã đánh dấu trong bể ổn nhiệt ở 900C trong 10 phút sau đó ngay lập tức để trên đá trong 5 phút
Lai: Chuyển màng sang dung dịch đệm lai đã bổ sung đầu dị biến tính và duy trì ở nhiệt độ lai trong 1 giờ
Chuyển màng vào dung dịch rửa để loại bỏ đầu dò dƣ thừa.
Khóa màng gồm 2 bƣớc:
Rửa màng với đệm rửa U1 ở nhiệt độ phòng trong 1 phút
Ủ màng với 1,5 ml đệm rửa U1 đã bổ sung 1 µl Tween 20 ở nhiệt độ phịng trong 20 phút
Phát hiện đầu dò gồm 4 bƣớc:
Chuyển màng vào dung dịch đệm rửa U1 có SA-AP (pha lỗng 1500 lần) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
Loại bỏ dung dịch. Rửa màng với đệm rửa U1 ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Lặp lại thêm một lần nữa
Loại bỏ dung dịch. Rửa màng với đệm rửa U2 ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
Thêm cơ chất của enzyme Alkaline Phosphatase. Quá trình ủ tránh ánh sáng. Quan sát tín hiệu sau 30 phút-60 phút.