1.3. KỸ THUẬT LAI ĐIỂM
1.3.1. Nguyên tắc chung kỹ thuật lai axit nucleic
Lai axit nucleic bao gồm hỗn hợp sợi đơn từ hai nguồn khác nhau: phân tử đầu dò (DNA tách dịng hoặc oligonucleotide) và phân tử đích. Nếu ban đầu, hai phân tử này ở dạng sợi đơi thì chúng phải đƣợc tách thành sợi đơn dƣới tác dụng của các yếu tố gây biến tính nhƣ kiềm, ure hoặc nhiệt độ cao. Khi đó, các liên kết hydro giữa hai mạch đơn bị bẻ gãy nhƣng không ảnh hƣởng tới các liên kết phosphodieste. Nếu các tác nhân biến tính bị loại bỏ và duy trì điều kiện mơi trƣờng thích hợp, hai sợi đơn trình tự base tƣơng đồng có thể liên kết tạo cặp trở lại (hồi tính DNA). Trong trƣờng hợp hai mạch đơn có nguồn gốc khác nhau và có trình tự tƣơng đồng, chúng bắt cặp tạo nên phân tử lai. Hiện tƣợng tái bắt cặp nhƣ trên đƣợc gọi là quá trình lai phân tử [58].
Kỹ thuật lai đƣợc sử dụng nhiều nhất là các kỹ thuật lai pha rắn. Thông thƣờng, pha rắn là màng nitrocellulose hoặc màng nylon [59]. Quá trình lai pha rắn sử dụng màng có thể chia thành 3 giai đoạn chính [4]:
Giai đoạn đầu tiên: DNA đích cố định trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon
đƣợc ủ tiền lai với dung dịch có chứa hóa chất khóa các vị trí của phân tử DNA khơng đặc hiệu bám trên bề mặt, nhờ đó giảm tín hiệu nền. Hóa chất khóa màng có thể là dung dịch Denhardt hoặc DNA của tinh trùng cá hồi đã biến tính [4].
Giai đoạn thứ hai: dung dịch tiền lai đƣợc thay thế bởi dung dịch lai có chứa đầu
dị đƣợc đánh dấu, ủ trong điều kiện thích hợp cho phép đầu dị bám vào trình tự đích. Trong suốt q trình lai, đầu dị khơng chỉ lai với trình tự đích bổ sung 100% với nó mà cịn bám vào các trình tự tƣơng đồng [4]. Thơng số đƣợc quan tâm trong một phản ứng lai là nhiệt độ nóng chảy Tm. Tm là nhiệt độ mà tại đó 50% phân tử DNA tồn tại ở dạng sợi đơn, cho phép đánh giá sự ổn định sợi đôi axit nucleic.
Chuỗi axit nucleic càng dài, thành phần GC trong chuỗi càng cao thì đầu dị sẽ có số lƣợng liên kết hidro càng lớn và Tm càng cao [58]. Đầu dò sử dụng cho các kỹ
thuật lai pha rắn sử dụng màng thƣờng ngắn hơn 500 bp, thành phần GC nằm trong khoảng 40%-60% để hạn chế các yếu tố ảnh hƣởng trên [4, 16, 17]. Trong mơi trƣờng hóa học của phản ứng lai, các cation hóa trị một (ví dụ nhƣ Na+) sẽ làm ổn định cấu trúc sợi đôi trong khi phân tử phân cực nhƣ formamide và urea là các hóa chất gây biến tính DNA [58].
Giai đoạn cuối cùng: Màng đƣợc rửa với một loạt các dung dịch để chỉ giữ lại cấu
trúc phân tử lai có mức độ tƣơng đồng cao nhất [4]. Phản ứng rửa đƣợc tiến hành để loại bỏ các đầu dị khơng lai với phân tử đích và phá vỡ các cấu trúc lai có nhiều vị trí bắt cặp sai. Khơng giống với phản ứng lai, phản ứng rửa phụ thuộc vào mức độ ổn định của cấu trúc lai. Cấu trúc lai đầu dò-phân tử đích ổn định nhất khi có sự kết cặp bổ sung hồn tồn. Các dung dịch rửa có thể tiến hành ở điều kiện khắt khe để phá vỡ sợi đơi có sự tƣơng đồng thấp. Điều kiện cho kỹ thuật lai liên quan tới nhiệt độ và nồng độ muối trong dung dịch. Điều kiện chỉ cho phép giữ lại cấu trúc lai bắt cặp hoàn hảo đƣợc gọi là điều kiện khắt khe. Điều kiện cho phép cấu trúc lai có nhiều vị trí khơng bắt cặp đƣợc gọi là điều kiện ít khắt khe. Nhƣ vậy, nồng độ muối thấp và nhiệt độ cao là điều kiện khắt khe, ngƣợc lại, nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp là điều kiện ít khắt khe [59].
Một số kỹ thuật lai trên pha rắn có nhiều ứng dụng nhƣ kỹ thuật lai Southern blot, Northern blot, lai điểm dot blot. Kỹ thuật lai Southern blot phân biệt một đoạn DNA cụ thể có mặt trong hỗn hợp DNA. Trong kỹ thuật này, trình tự DNA đích bị cắt bởi một hay nhiều enzyme giới hạn tạo thành các đoạn đƣợc phân tách trên gel agarose nhờ điện di. Sau đó, các đoạn DNA đƣợc biến tính trong dung dịch kiềm để thành sợi đơn rồi chuyển lên màng nitrocellulose hoặc màng nylon để lai [58]. Kỹ thuật Northern blot là một cải biến của Southern blot trong đó phân tử axit nucleic đích là RNA thay vì DNA. RNA hoặc DNAc đã đƣợc nhân dịng có thể sử dụng làm đầu dò trong lai Northern blot [58]. Dựa trên nguyên tắc lai axit nucleic, kỹ thuật lai điểm dot blot đƣợc
Kafatos và cs. mô tả năm 1979 nhằm phát hiện phân tử đích quan tâm. Thao tác thực hiện kỹ thuật này đơn giản. Khác với Southern blot, DNA đích trong kỹ thuật lai điểm dot blot không cần phải cắt với enzyme giới hạn và phân tách trên gel trƣớc khi chuyển lên màng lai. DNA đích đã biến tính đƣợc chấm lên màng nitrocellulose hoặc màng nylon và để khơ. Sau đó, tiến hành cố định DNA trên màng bằng cách chiếu tia UV trong vài phút hoặc ủ 800C trong 30 phút [4]. DNA cố định trên màng sẽ đƣợc tiếp xúc với dung dịch chứa đầu dò đánh dấu. Sau khoảng thời gian đủ để hình thành cấu trúc lai đầu dị-phân tử đích, dung dịch chứa đầu dị đƣợc loại bỏ. Màng đƣợc rửa để loại đầu dị cịn sót, để khơ và thu tín hiệu lai điểm [4].