Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.6. ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC
Cho đến nay, đầu dị axit nucleic nói chung và đầu dị ADN nói riêng đã đƣợc cải biến để không chỉ phù hợp trong nghiên cứu mà còn thuận lợi trong ứng dụng thực tế [47]. Thứ nhất, nguồn tổng hợp đầu dò chuyển từ nhân dòng và cADN sang oligonucleotide sợi đơn và ARN. Thứ hai là sự phát triển của các kỹ thuật đánh dấu phóng xạ và khơng phóng xạ. Thứ ba phải kể đến sự ra đời của kỹ thuật khuếch đại axit nucleic cho phép phát hiện lƣợng axit nucleic dƣới attomol, điều mà các kỹ thuật lai truyền thống không thể thực hiện đƣợc. Thứ tƣ, sự cải tiến của các hệ thống tín hiệu cũng góp phần tăng độ nhạy phát hiện [47]. Thứ năm, các phƣơng pháp xử lý mẫu đƣợc cải tiến để rút ngắn thời gian thao tác. Cuối cùng, việc sản xuất đầu dò phân tử một cách tự động thúc đẩy việc đƣa chúng trở thành xét nghiệm thƣờng quy trong các phịng thí nghiệm cận lâm sàng [12].
Lai tại chỗ CISH thể hiện rõ ƣu thế của mình trong nghiên cứu gen HER- 2/neu, một yếu tố tiên lƣợng quan trọng của bệnh ung thƣ vú [22]. HER-2/neu là thụ
thể của yếu tố tăng trƣởng biểu bì. Khoảng 20-30% các trƣờng hợp ung thƣ vú có biểu hiện quá mức thụ thể này trên bề mặt tế bào [46]. Hiện nay, nhiều kỹ thuật đã đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ khuếch đại của gen HER-2/neu. Phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch IHC tiện lợi, tiết kiệm, dễ dàng bảo quản mẫu sau khi phân tích và chỉ cần sử dụng kính hiển vi thơng thƣờng khi quan sát. Tuy nhiên, bất lợi của phƣơng pháp này là kết quả phụ thuộc vào một số yếu tố nhƣ điều kiện bảo quản trƣớc đó, thời gian và kỹ thuật cố định bệnh phẩm, loại kháng thể dùng để nhuộm (đơn dòng hay đa dịng), và quan trọng hơn cả đó là khó khăn khi áp dụng bảng tính điểm để có kết luận chính xác [44]. FISH là một phƣơng pháp xét nghiệm chính xác với độ
nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện sự khuếch đại bất thƣờng của gen HER-2/neu nhƣng đòi hỏi giá thành cao, phải quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang và đơi khi khó xác định trong những trƣờng hợp u bƣớu xâm lấn [44]. CISH đƣợc coi là một chọn lựa thay thế với ƣu điểm của cả hai phƣơng pháp IHC và FISH. Với kỹ thuật này, gen HER-2/neu đƣợc phát hiện bằng phản ứng peroxidase quan sát dƣới kính
hiển vi ánh sáng thƣờng trong khi chi phí chỉ bằng 1/4 của FISH [22]. Hiện nay, kết quả FISH hoặc CISH phát hiện sự khuếch đại bất thƣờng của gen HER-2/neu đƣợc cơ quan kiểm định thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) xác nhận là tiêu chuẩn chẩn đoán vàng đối với ung thƣ vú [24].
Trong công nghệ thực phẩm, lai FISH cũng đƣợc ứng dụng để phát hiện các vi khuẩn lactic trong môi trƣờng sữa cho sản xuất pho mát và định lƣợng vi khuẩn ruột kết trong thực phẩm lên men [8, 34]. Hơn nữa, FISH còn là phƣơng pháp thuận lợi để phát hiện sự sinh trƣởng độc lập của các vi sinh vật trong nhiều loại mẫu khác nhau [5]. Lactobacillus là một trong những vi khuẩn có lợi, chiếm ƣu thế trong cơ thể con ngƣời và đƣợc sử dụng nhƣ một "tá dƣợc vi sinh vật" ở các nƣớc phát triển [46]. Việc xác định các vi khuẩn probiotic thông thƣờng đƣợc thực hiện nhờ kỹ thuật nuôi cấy. Tuy nhiên, phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian và có thể cho kết quả khơng chính xác, đặc biệt khi có mặt Lactobacillus trong hỗn hợp vi khuẩn.
Nghiên cứu của Machado và cs. nhằm xác định chính xác Lactobacillus spp. nhờ
thiết kế đầu dò dùng trong kỹ thuật lai FISH [43]. Đầu dò Lac663 đã đƣợc thử nghiệm trên 36 chủng khác nhau thuộc loài Lactobacillus và 20 chủng của các loài vi khuẩn khác. Phƣơng pháp có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 95% [43]. Thêm vào đó, nhóm nghiên cứu còn thử nghiệm trên các mẫu sữa có bổ sung các chủng
Lactobacillus theo một dải nồng độ và các vi khuẩn liên quan khác cũng nhƣ các vi
khuẩn gây bệnh. Kết quả cho thấy đầu dò Lac663 gắn đặc hiệu với các chủng
Lactobacillus và kỹ thuật FISH có thể định lƣợng trực tiếp Lactobacillus ssp. ở
Đầu dò ADN còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật lai để phát hiện vi sinh vâ ̣t gây hại, phát hiện các trình tự lặp lại và phát hiê ̣n sƣ̣ thay đổi axit nucleic [5, 46]. Đầu dị có thể đƣợc sử dụng để phát hiện các vi sinh vật không thể nuôi cấy và các mầm bệnh trong môi trƣờng hoặc chỉ đơn giản là xác định nhanh chóng các lồi và dƣới lồi [5]. Trong nghiên cƣ́ u để phát hiê ̣n rotavirus , Fernandez và cs. đã thiết kế đầu dò là mô ̣t trình tƣ̣ dài 40 nucleotide tƣơng đồng với nucleotide 33 - 72 của gen mã hóa cho glycoprotein VP 7 của rotavirus chủng NCDV [18]. Đây là đoa ̣n trình tự bảo thủ cao ở tất cả các chủng rotavirus tại thời điểm nghiên cứu. Tính đặc hiệu của đầu dò thể hiện ở chỗ không lai với adenovirus, virus hơ ̣p bào hô hấp (respiratory syncytia virus ) hay các virus có hê ̣ gen ARN khác nhƣ reo hoặc pararotavirus. Đầu dò này đƣợc sử dụng trong kỹ thuâ ̣t lai điểm với ARN hê ̣ gen rotavirus tách chiết từ 303 mẫu phân trẻ em bi ̣ tiêu chảy cấp . Kết quả cho thấy kỹ thuâ ̣t lai có đô ̣ nha ̣y và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u cao hơn kỹ thuâ ̣t điê ̣n di PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis) kết hợp với nhuộm ba ̣c : độ nhạy trong lai điểm (200 pg) cao hơn nhiều so với đô ̣ nha ̣y khi điê ̣n di và nhuô ̣m ba ̣c (20ng); 24 mẫu cho kết quả âm tính khi điện di nhƣng cho kết quả dƣơng tính khi lai với đầu dò. Khơng nhƣ̃ng thế, sƣ̉ du ̣ng đầu dò này còn giúp loa ̣i bỏ các trƣờng hợp dƣơng tính giả khi phát hiê ̣n rotavirus thông qua kháng nguyên bề mă ̣t virus [18]. Với nhƣ̃ng ƣu điểm đó , chẩn đoán bằng kỹ thuâ ̣t lai sƣ̉ dụng đầu dị khơng phóng xạ có tiềm năng trở thành xét nghiê ̣m thƣờng quy ta ̣i các bê ̣nh viê ̣n [18].
Các trình tự lặp lại thƣờng có chiều dài 30-50bp. Kích thƣớc và sự phân bố của chúng khác nhau ở mỗi cá thể . Chúng có thể đƣợc phát hiện nhờ sử dụng đầu dò axit nucleic và PCR . Phƣơng pháp "dấu vân tay ADN" (ADN fingerprinting) dùng trong khoa học hình sự để xác nhận danh tính của một nghi phạm từ mẫu vật (dịch cơ thể, da và tóc) để lại tại hiện trƣờng vụ án [67]. Phƣơng pháp này cũng có thể đƣợc sử dụng cho các xét nghiệm quan hệ cha con, xác nhận anh, chị, em ruột và phân loại mô. Nghiên cƣ́u 21 trƣờng hợp, Moliaka và cs. cho thấy , đầu dò đa locus (Red4) và hai đầu dò đơn locus (YNH24, CMM101) phát hiện tính đa hình
cao (96%) ở hai locus D 2S44 và D14S13 [49]. Sƣ̣ kết hơ ̣p của hai loa ̣i đầu dò này cho phép xét nghiệm quan hệ cha con trong pháp y và y tế [49].
Sƣ̣ thay đổi trình tƣ̣ ADN là những đột biến mất , thêm hoặc thay thế nucleotide. Sƣ̣ thay đổi trong trình tƣ̣ gen cu ̣ thể có thể gây bê ̣nh di truyền nhƣ xơ nang, loạn dƣỡng cơ, phenyl keto niệu, biến đổi apolipoprotein, thiếu máu huyết tán đều có thể chẩn đốn bởi sự phát hiện đầu dị [17, 61, 68, 74]. Kỹ thuật lai axit nucleic rất thành công trong viê ̣c phát hiê ̣n nhiều đô ̣t biến [37, 48]. Với mơ ̣t sớ bê ̣nh di trùn có thể có nhiều đơ ̣t biến gây bê ̣nh , trong trƣờng hợp này, đầu dò có thể dùng ở điều kiện lai ít nghiêm ngặt hoặc dùng một số đầu dị để đảm bảo lai với tất cả các trình tự đích. Thalassemia là một trong những bệnh di truyền phổ biến gây ra bởi các biến đổi về trình tự gen α-globin hoặc β-globin [48]. Trong nghiên cứu vào
năm 2012, Lin và cs. đã thiết lập phƣơng pháp lai điểm ngƣợc nhằm phát hiện 5 đột biến gây bệnh α-thalassemia và 16 đột biến gây bệnh β-thalassemia [38]. Kết quả thu đƣợc hoàn toàn phù hợp với kỹ thuật giải trình tự và gap-PCR (sử dụng kit thƣơng mại). Hơn nữa, phƣơng pháp này có thể sử dụng trong phân tích nhiều loại mẫu khác nhau nhƣ máu, dịch màng ối, lông nhung màng đệm và máu cuống rốn [38]. Đầu năm 2013, một quy trình lai điểm ngƣợc cho phép phát hiện 11 đột biến gây bệnh thiếu hụt men G6PD đƣợc công bố bởi Lu và cs. [42]. Áp dụng trên 213 mẫu bệnh phẩm và so sánh với kết quả giải trình tự trực tiếp, quy trình thu đƣợc mức độ phát hiện đạt 95,8%. Nhƣ vậy lai điểm ngƣợc reverse dot blot đã cung cấp một phƣơng pháp sàng sàng lọc di truyền hiệu quả, năng suất cao, tiến hành dễ dàng và đảm bảo độ tin cậy [11, 19, 42].
Dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật lai điểm ngƣợc, một số hãng thƣơng mại đã sản xuất các bộ kit phục vụ chẩn đoán thƣờng quy. Điển hình nhƣ kit phát hiện virus viêm gan B (Hepatitis B Virus - HBV) INNO-LiPA HBV Genotyping assay (Innogenetics N. V., Ghent, Bỉ) có độ nhạy 99,3% và độ đặc hiệu 100% [51, 52].
Nhƣ vậy, kỹ thuật lai điểm và lai điểm ngƣợc đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi, cho thấy ƣu điểm vƣợt trội trong phát hiện sự khác biệt về trình tự
axit nucleic so với các phƣơng pháp khác. Tại Việt Nam, kỹ thuật lai điểm ngƣợc đã đƣợc ứng dụng trong định type virus HPV (Human Papillomavirus) liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung [3]. Đây là loại ung thƣ thƣờng gặp ở phụ nữ, đứng hàng thứ hai sau ung thƣ vú tại Hà Nội và đứng đầu tại Thành phố Hồ Chí Minh [2]. Bộ kit LightPower iVAHPV Genotype RDB do Công ty cổ phần cơng nghệ Việt Á sản xuất có thể xác định sự đồng nhiễm của 8 type HPV nguy cơ thấp và 16 type HPV nguy cơ cao [84]. Tuy nhiên, đây là bộ kit duy nhất dựa trên kỹ thuật lai điểm ngƣợc đƣợc sử dụng ở nƣớc ta.
Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thƣờng phổ biến trên thế giới, do đột biến trên gen β-globin gây ra sự giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β-
globin. Tại Việt Nam, tỷ lệ ngƣời mang đột biến gây bệnh β-thalassemia là 1,5-25% [62]. Cho đến nay, khoảng hơn 200 đột biến đã đƣợc tìm thấy trên gen β-globin
[48]. Các đột biến này mang tính đặc trƣng và phân bố với tỷ lệ khác nhau ở từng dân tộc. Ở nƣớc ta hiện nay, các xét nghiệm cận lâm sàng hỗ trợ chẩn đoán bệnh β- thalassemia tại các bệnh viện chủ yếu là tổng phân tích tế bào máu ngoại vi, điện di huyết sắc tố và PCR với cặp mồi đặc hiệu. Tuy nhiên, phƣơng pháp này chỉ phát hiện đƣợc một hoặc một số đột biến đồng thời và ngƣời thực hiện phải tiếp xúc với hóa chất độc hại nhƣ ethidium bromide. Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: "Thiết
kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai điểm dot blot" với mục đích: (1) thiết lập đƣợc
quy trình lai điểm để phân biệt hai trình tự tƣơng đồng chỉ sai khác nhau tại một số vị trí nucleotide; (2) thiết kế đầu dị và chuẩn hóa đƣợc điều kiện cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc phát hiện một số đột biến điểm phổ biến gây bệnh β-thalassemia.