Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
A- KẾT QUẢ
3.1. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM
3.1.2. So sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG
Với mong muốn so sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG, chúng tôi chấm 2 µl mỗi loại đầu dị (thu đƣợc từ mục 3.1.1) lên màng nylon. Đồng thời, để kiểm tra độ nhạy của kỹ thuật lai điểm, chúng tơi pha lỗng đoạn M khơng đánh dấu theo dải nồng độ 5 ng/µl, 10 ng/µl, 20 ng/µl, 40 ng/µl, sau đó sử dụng 2 µl mỗi nồng độ để chấm lên màng. Các bƣớc trong quy trình lai điểm bao gồm biến tính và cố định ADN trên màng, tiền lai và lai, phát hiện đầu dò đánh dấu biotin và DIG đƣợc tiến hành cụ thể nhƣ đã trình bày trong mục 2.2.3. Chúng tơi thăm dị dải nhiệt độ lai: 550C, 600C, 650C và 700C. Sau khi ủ màng với cơ chất của enzyme alkaline phosphatase (hỗn hợp dung dịch NBT/BCIP) trong tối, chúng tơi quan sát kết quả. Hình 11 minh họa cho kết quả lai điểm ở nhiệt độ lai 600C và 650C. Chúng tôi nhận thấy ở nhiệt độ lai 650C các chấm có tín hiệu rõ ràng hơn cả. Phông màng sạch chứng tỏ bƣớc rửa sau lai đã loại bỏ đƣợc đầu dị dƣ thừa bám vào màng. Các vị trí chấm đầu dị đánh dấu biotin và DIG đều lên màu chứng tỏ đầu dò đánh dấu tốt. Ở cả hai nhiệt độ 600
C và 650C hầu nhƣ khơng có sự khác biệt đáng kể giữa hai loại chất đánh dấu biotin (224$/50 µl biotin-11-dUTP, Fermentas) và DIG (227$/25 µl DIG-11-dUTP, Roche). Do đó, để tiết kiệm chi phí, chúng tôi sử dụng biotin để đánh dấu đầu dị trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 11: Kết quả so sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG và kiểm tra độ nhạy
của kỹ thuật lai điểm. 5, 10, 20, 40 ng: nồng độ đoạn M không đánh dấu; M*: đầu dò đánh dấu biotin hoặc DIG.
Kết quả trên Hình 11 cho thấy, khi nồng độ đoạn M khơng đánh dấu giảm dần thì chấm tƣơng ứng cũng nhạt dần. Ở nồng độ đoạn M thấp nhất trong thí nghiệm này là 5 ng, chúng tơi vẫn quan sát đƣợc tính hiệu rõ nét. Chúng tơi tiếp tục sử dụng nồng độ này cho thí nghiệm lai nhằm phân biệt hai đoạn trình tự đích và trình tự đối chứng.