Thiết kế đầu dò

Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Thiết kế đầu dò

Trong thí nghiệm lai điểm, đoạn M (mang trình tự lõi của đoạn C) đƣợc sử dụng làm đầu dò với mong muốn phân biệt sự khác biệt giữa trình tự C và trình tự T (Hình 8).

Đối với thí nghiệm lai điểm ngƣợc, chúng tơi thiết kế ba cặp đầu dò oligo để phát hiện đồng thời ba đột biến điểm trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia: đột biến tại Cd 17 [A → T], Cd 26 [G → A]) và Cd 41-42 [-TCTT]. Mỗi cặp đầu dò gồm một đầu dị bình thƣờng (bổ sung với trình tự trên gen β-globin của ngƣời bình thƣờng) và một đầu dị đột biến (bổ sung với trình tự trên gen β-globin của ngƣời

Hình 9: Vị trí các đầu dị oligo và cặp mồi CD F/R trên gen β-globin [81]. Trình tự ADN

gạch chân là vị trí của cặp mồi CD F/R. Trình tự màu xanh tƣơng ứng với vị trí oligo CD17 N/M (chứa Cd 17 [A → T]); Trình tự màu vàng tƣơng ứng với vị trí oligo CD26 N/M (chứa Cd 26 [G → A]); Trình tự màu xám tƣơng ứng với vị trí oligo CD41 N/M (chứa Cd 41-42 [-TCTT]); Các nucleotide màu đỏ là vị trí xảy ra đột biến.

2.2.2. Phương pháp PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại một hay nhiều đoạn ADN. Thành phần chính của phản ứng gồm có khn ADN, mồi, Taq ADN polymerase và dNTP. Phản ứng này gồm có ba giai đoạn chính:

 Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (940

- 950C) để tách hai mạch của chuỗi ADN xoắn kép.

 Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ của phản ứng đƣợc hạ xuống để các mồi gắn bổ

sung với sợi ADN khuôn. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào thành phần nucleotide và chiều dài của mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu.

 Giai đoạn kéo dài: Sử dụng một mạch ADN làm khuôn, ADN polymerase tổng hợp mạch polynucleotide mới theo nguyên tắc bổ sung.

Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại các đoạn C, đoạn T, đầu dò M và đoạn gen β-globin. Thành phần và điều kiện phản ứng

Bảng 5: Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn C và T Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n

H2O 11,3 Biến tính lần đầu: 940 C trong 3 phút Lặp lại 45 chu kỳ: Biến tính : 940 C trong 30 giây Gắn mồi : 650 C trong 10 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 10 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 10x (15mM Mg2+ ) 1,5 dNTP 2 mM mỗi loại 0,5 CT F 10 µM 0,25 CT R 10 µM 0,25

JumpStart Taq ADN

polymerase 2,5 u/µl 0,2

ADN khn 1,0

Tởng thể tích 15,0

Ngồi ra, phƣơng pháp này cịn dùng để đánh dấu đầu dò M và đoạn gen β- globin với biotin (sử dụng biotin-11-dUTP) và digoxigenin (sử dụng DIG-11-dUTP).

PCR đa mồi là một dạng cải tiến của kỹ thuật PCR thông thƣờng. Đây là kĩ thuật sử dụng từ hai cặp mồi trở lên trong cùng một hỗn hợp phản ứng để phát hiện hai hay nhiều trình tự quan tâm, giúp tiết kiệm hoá chất và thời gian tiến hành PCR. Điều kiện cho phản ứng PCR đa mồi phụ thuộc vào điều kiện tối ƣu cho sự bắt cặp của từng cặp mồi. Chúng tôi sử dụng phản ứng PCR đa mồi để sàng lọc đồng thời đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin cho 30 mẫu bệnh phẩm.

2.2.3. Quá trình lai điểm

2.2.3.1. Biến tính và cố định ADN trên màng nylon (Roche)

 Biến tính ADN trên màng nylon: 2 µl (nồng độ 5 ng/µl) sản phẩm PCR khuếch đại đoạn C và đoạn T (với cặp mồi CT F/R) đƣợc chấm lên màng nylon (Roche). Chuyển màng vào dung dịch B1 (NaOH 0,5M; NaCl 1,5M) trong 10 phút. Tiếp theo màng đƣợc chuyển vào dung dịch B2 (Tris-HCl 0,5M pH 7,6; NaCl 1,5M) trong 10 phút, sau đó để khơ màng;

 Cố định ADN trên màng nylon tích điện dƣơng bằng UV: chiếu tia cực tím ở bƣớc sóng 254 nm trong 1 phút 30 giây.

2.2.3.2. Tiền lai và lai Đối với đầu dò đánh dấu biotin Đối với đầu dò đánh dấu biotin

 Tiền lai: chuyển màng vào đệm lai H1 (SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1%) trong 30 phút ở nhiệt độ lai;

 Biến tính đầu dị M đánh dấu biotin: bổ sung 15 µl đầu dị M vào 100 µl đệm lai H1, ủ 950C trong 5 - 10 phút rồi chuyển ngay lên đá;

 Cho đầu dị đã biến tính vào 1,5 ml đệm lai H1. Chuyển màng sang dung dịch này và duy trì ở nhiệt độ lai trong 60 phút;

 Rửa màng để loại bỏ đầu dò dƣ thừa: chuyển màng vào dung dịch rửa W1 (SSC 2x; SDS 0,1%) ở nhiệt độ lai trong 5 phút.

Đối với đầu dò đánh dấu DIG

 Tiền lai: chuyển màng vào đệm lai H2 (SSC 5x; Blocking 1x 10%; SDS 0,1%) trong 30 phút ở nhiệt độ lai;

 Biến tính đầu dị M đánh dấu DIG: bổ sung 15 µl đầu dị M vào 100 µl đệm lai H2, ủ 950C trong 5 - 10 phút rồi chuyển ngay lên đá;

 Cho đầu dị đã biến tính vào 1,5 ml đệm lai H2. Chuyển màng sang dung dịch này và duy trì ở nhiệt độ lai trong 60 phút;

 Rửa màng để loại bỏ đầu dò dƣ thừa: chuyển màng vào dung dịch rửa W1 (SSC 2x; SDS 0,1%) ở nhiệt độ lai trong 5 phút.

2.2.3.3. Phát hiện đầu dò Đối với đầu dò đánh dấu biotin Đối với đầu dò đánh dấu biotin

"Khóa" màng

 Rửa màng với đệm U1 (Tris-HCl 1M pH 7,5; NaCl 1,5M) trong 1 phút ở nhiệt độ phòng;

 Ủ màng với dung dịch Denhardt 5x (pha loãng từ dung dịch Denhardt 50x trong đệm U1) trong 30 phút ở nhiệt độ lai;

Gắn đầu dò với Streptavidin Alkaline phosphatase (SA-AP)

 Pha loãng SA-AP trong đệm U1 (SA-AP : đệm U1 = 1: 5000). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng;

 Loại bỏ dung dịch trên. Rửa màng với đệm U1 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lặp lại một lần;

 Ủ màng với dung dịch đệm U2 (Tris-HCl 0,1M pH 9,5; NaCl 0,1M; MgCl2 0,05M) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Phát hiện đầu dò

 Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase. Quá trình ủ tránh ánh sáng. Quan sát kết quả sau 30 - 60 phút.

Đối với đầu dị đánh dấu DIG "Khóa" màng

 Ủ màng với đệm Blocking 1x trong 30 phút ở nhiệt độ lai;

Gắn đầu dò với Anti-Digoxigenin Alkaline phosphatase (AD-AP)

 Pha loãng AD-AP trong đệm Bocking 1x (AD-AP : đệm Blocking 1x = 1: 5000). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng;

 Loại bỏ dung dịch trên. Rửa màng với đệm đệm U3 (Axit maleic 0,1M, NaCl 0,15M, pH 7,5, Tween 20 0,3%) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lặp lại một lần;

 Ủ màng với dung dịch đệm U4 (Tris-HCl 0,1M pH 9,5; NaCl 0,1M ) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Phát hiện đầu dò

 Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase. Quá trình ủ tránh ánh sáng. Quan sát kết quả sau 30 - 60 phút.

2.2.4. Quá trình lai điểm ngược

2.2.4.1. Hoạt hóa màng nylon (Pall)

 Chuyển màng vào dung dịch EDC 16%, lắc nhẹ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng;  Tráng nhẹ màng với nƣớc và để khơ màng.

2.2.4.2. Cố định đầu dị trên màng nylon (Pall)

 Đầu dò oligo (Bảng 4) đƣợc pha loãng đến nồng độ 100 nM trong đệm NaHCO3/Na2CO3 0,5M, pH 8,4;

 Chấm 2 µl đầu dị đã pha loãng lên màng, để khô 15 phút, cố định bằng NaOH 0,5 N trong 1 phút.

2.2.4.3. Tiền lai và lai

 Tiền lai: chuyển màng vào đệm lai H3 (SSC 2x; SDS 0,1%) trong 30 phút ở nhiệt độ lai;

 Biến tính đoạn gen β-globin đánh dấu biotin trong đệm lai H3: bổ sung 45 µl sản phẩm PCR với cặp mồi CD F/R (bổ sung biotin-11-dUTP) vào 100 µl đệm lai, ủ 950

 Cho sản phẩm biến tính vào 1,5 ml đệm lai H3. Chuyển màng sang dung dịch này và duy trì ở nhiệt độ lai trong 60 phút;

 Rửa màng để loại bỏ đầu dò dƣ thừa: chuyển màng vào dung dịch rửa W2 (SSC 2x) ở nhiệt độ lai trong 5 phút.

2.2.4.4. Phát hiện đầu dị đánh dấu biotin "Khóa" màng "Khóa" màng

 Rửa màng với đệm U5 (Tris-HCl 0,1M pH 7,5; NaCl 0,15M) trong 1 phút ở nhiệt độ phòng;

 Ủ màng với dung dịch 5x Denhardt (pha loãng từ dung dịch Denhardt 50x trong đệm U5) trong 30 phút ở nhiệt độ lai.

Gắn đầu dị với SA-AP

 Pha lỗng SA-AP trong đệm U5 (SA-AP : đệm U3 = 1: 5000). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng;

 Sau khi loại bỏ dung dịch trên, chuyển màng vào đệm U5 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lặp lại một lần;

 Ủ màng với dung dịch đệm U2 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Phát hiện đầu dò

 Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase và ủ màng trong tối. Quan sát kết quả sau 30 - 60 phút.

2.2.5. Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm

ADN đƣợc tách chiết từ mẫu máu ngƣời bệnh thalassemia bằng kit ReliaprepTM Blood gADN MiniPrep System (Promega). Quy trình gồm các bƣớc chính nhƣ sau:

 Mẫu máu bảo quản ở -800C đƣợc lấy ra để tan hoàn toàn, trộn đều nhẹ nhàng trong 10 phút

 Chia 20 µl Proteinase K vào các ống eppendorf 1,5 ml  Thêm 200 µl máu vào mỗi ống

 Thêm 200 µl đệm Cell lysis, trộn đều và ủ 10 phút ở 560C  Bổ sung 250 µl đệm Binding, trộn đều

 Chuyển hỗn hợp lên cột. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch

 Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 500 µl dung dịch Column Wash. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 3 phút, loại dịch. Lặp lại bƣớc này 2 lần

 Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml. Thêm 200 µl H2O và ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu dịch chứa ADN. Bảo quản ở -200C.

2.2.6. Tách plasmid

Quy trình tách chiết plasmid gồm các bƣớc cơ bản sau:

 Ly tâm (6000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút) 1,5 ml dịch nuôi tế bào bão hòa qua đêm rồi loa ̣i bỏ di ̣ch trong

 Hòa tan cặn tế bào trong 100 µl dung dịch I (Tris-HCl 25 mM pH 8, glucose 50 mM, EDTA 10 mM pH 8) có bổ sung RNase 20 µg/ml, ủ 15 phút ở nhiệt đô ̣ phòng

 Thêm 200 µl dung dịch II (NaOH 0,2 N, SDS 1%), trộn nhe ̣, ủ trên đá trong 3 phút

 Thêm 150 µl dung dịch III (CH3COOK 3M pH 5,2), trộn nhe ̣, ủ trên đá trong 5 phút

 Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25: 24 : 1), trô ̣n nhe ̣  Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên  Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

 Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu tủ a

 Rƣ̉a tủa bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 vịng/phút ở 40C trong 5 phút, thu tủa và làm khô tủa

 Hịa tủa trong 30µl H2O, bảo quản ở -200C.

2.2.7. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit High pure PCR cleanup micro (Roche)

Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng kit gồm các bƣớc chính nhƣ sau:

 Cắt băng ADN từ gel agarose đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml và cân khối lƣợng miếng gel

 Bổ sung 300 µl đệm Bingding cho mỗi 100 mg gel. Ủ ở 560

C trong 10 phút  Bổ sung 100 µl đệm Binding Enhancer cho mỗi 100 mg gel, trộn đều

 Chuyển hỗn hợp lên cột và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để bỏ hết dịch qua cột

 Thêm 400 µl đệm Wash, ly tâm 13000 vịng/phút trong 1 phút, bỏ dịch  Thêm 300 µl đệm Wash, ly tâm 13000 vịng/phút trong 1 phút, bỏ dịch

 Thêm 20 µl H2O vào giữa cột và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu lấy phần dịch. Bảo quản ở -200C.

2.2.8. Phương pháp điện di

Điện di là phƣơng pháp phổ biến để phân tách các phân tử axit nucleic. Dƣới tác dụng của điện trƣờng một chiều, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng nhờ có nhóm phosphat tích điện âm. Các phân tử ADN đƣợc phân tách dựa vào kích thƣớc

và cấu hình. Có hai loa ̣i gel đƣợc dùng phổ biến là agarose và polyacrylamide (Bảng 6). Hai loại gel này đƣợc dùng để điện di ADN trong đệm TBE 1x (Tris base, Axit boric, EDTA). Các băng ADN đƣợc phát hiện dƣớ i tia tƣ̉ ngoa ̣i sau khi nhuô ̣m với ethidium bromide.

Bảng 6: Thành phần gel polyacrylamide 8% dùng trong phân tách ADN Thành phần Thể tích (ml) H2O 3,135 TBE 10x 0,5 Bis-acrylamide 30% 1,33 APS 10% 0,035 TEMED 0,005 Tổng số 5

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

A - KẾT QUẢ

3.1. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM

3.1.1. Kết quả khuếch đại và đánh dấu đầu dị M

Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng plasmid pTZ57-M chứa đoạn chèn M để làm đầu dị. Đoạn M có trình tự 75 bp đƣợc lặp lại ba lần (Hình 8). Trình tự 75 bp giống hệt với một phần trình tự của đoạn C và sai khác 7 nucleotide với đoạn T. Với đặc điểm nhƣ vậy, đoạn M đƣợc chọn làm đầu dò để phân biệt đoạn C và đoạn T bằng kỹ thuật lai điểm. Đoạn M đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR với khuôn là plasmid pTZ57-M, cặp mồi vector M13 F/R cùng thành phần và điều kiện trình bày trong Bảng 7.

Bảng 7: Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đầu dò M Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n

H2O 11,3 Biến tính lần đầu: 940 C trong 3 phút Lặp lại 45 chu kỳ: Biến tính : 940 C trong 30 giây Gắn mồi : 620 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 10x (15mM Mg2+ ) 1,5 dNTP 2 mM mỗi loại 0,5 M13 F 10 µM 0,25 M13 R 10 µM 0,25

JumpStart Taq ADN

polymerase 2,5 u/µl 0,2 ADN khn 10 - 20 ng Tởng thể tích 15,0

Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8%. Kết quả trên Hình 10 cho thấy chúng tơi thu đƣợc băng ADN khoảng 380 bp. Đây là kích thƣớc đoạn ADN gồm đoạn chèn M cộng với khoảng cách giữa hai mồi M13 F và M13 R. Điều đó chứng tỏ chúng tơi đã khuếch đại đƣợc đoạn M.

Chúng tôi thực hiện phản ứng PCR để đánh dấu đầu dò M sử dụng nucleotide gắn chất đánh dấu biotin hoặc digoxigenin (DIG). Với điều kiện chu trình nhiệt khơng đổi nhƣng bổ sung thêm biotin-11-dUTP (hoặc DIG-11-dUTP) so với dTTP theo tỷ lệ tƣơng ứng trong Bảng 8, chúng tơi thu đƣợc kết quả trình bày trên Hình 10A và Hình 10B.

Bảng 8: Thành phần và điều kiện tối ƣu phản ứng đánh dấu đầu dò M với biotin và DIG Thành phần Biotin (µl) DIG (µl) Điều kiê ̣n

H2O 9,8 9,8 Biến tính lần đầu: 940 C trong 3 phút Lặp lại 45 chu kỳ: Biến tính : 940 C trong 30 giây Gắn mồi : 620 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C, 5 phút Đệm 10x (15mM Mg2+ ) 1,5 1,5 d(A, C, G)TP 1mM mỗi loại 1,0 1,0 dTTP 1mM 0,6 0,65 Biotin-11-dUTP 1mM 0,4 DIG-11-dUTP 1 mM 0,35 M13 F 10 µM 0,25 0,25 M13 R 10 µM 0,25 0,25

JumpStart Taq ADN

polymerase 2,5 u/µl 0,2 0,2 ADN 10 - 20 ng 10 - 20 ng Tởng thể tích 15,0 15,0

Đoạn M đƣợc đánh dấu có kích thƣớc cao hơn đoạn M khơng đánh dấu vì khối lƣợng phân tử của biotin-11-dUTP (927.6 Da) và DIG-11-dUTP (1090.7 Da) lớn hơn dTTP thông thƣờng (548.1 Da). Kết quả điện di trên Hình 10 chứng tỏ chúng tôi đã đánh dấu thành công đầu dị M với biotin và DIG.

Hình 10: Kết quả đánh dấu đầu dò M với biotin (A) và DIG (B). Giếng 1 và 3: lần

lƣợt là đầu dò M đánh dấu biotin và DIG; Giếng 2: đoạn M không đánh dấu; Giếng M: thang chuẩn SY 100 bp.

3.1.2. So sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG

Với mong muốn so sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG, chúng tơi chấm 2 µl mỗi loại đầu dị (thu đƣợc từ mục 3.1.1) lên màng nylon. Đồng thời, để kiểm tra độ nhạy của kỹ thuật lai điểm, chúng tơi pha lỗng đoạn M khơng đánh dấu theo dải nồng độ 5 ng/µl, 10 ng/µl, 20 ng/µl, 40 ng/µl, sau đó sử dụng 2 µl mỗi