Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3.3. Phát hiện đầu dò
Đối với đầu dị đánh dấu biotin
"Khóa" màng
Rửa màng với đệm U1 (Tris-HCl 1M pH 7,5; NaCl 1,5M) trong 1 phút ở nhiệt độ phòng;
Ủ màng với dung dịch Denhardt 5x (pha loãng từ dung dịch Denhardt 50x trong đệm U1) trong 30 phút ở nhiệt độ lai;
Gắn đầu dò với Streptavidin Alkaline phosphatase (SA-AP)
Pha loãng SA-AP trong đệm U1 (SA-AP : đệm U1 = 1: 5000). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng;
Loại bỏ dung dịch trên. Rửa màng với đệm U1 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lặp lại một lần;
Ủ màng với dung dịch đệm U2 (Tris-HCl 0,1M pH 9,5; NaCl 0,1M; MgCl2 0,05M) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Phát hiện đầu dò
Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase. Quá trình ủ tránh ánh sáng. Quan sát kết quả sau 30 - 60 phút.
Đối với đầu dò đánh dấu DIG "Khóa" màng
Ủ màng với đệm Blocking 1x trong 30 phút ở nhiệt độ lai;
Gắn đầu dò với Anti-Digoxigenin Alkaline phosphatase (AD-AP)
Pha loãng AD-AP trong đệm Bocking 1x (AD-AP : đệm Blocking 1x = 1: 5000). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng;
Loại bỏ dung dịch trên. Rửa màng với đệm đệm U3 (Axit maleic 0,1M, NaCl 0,15M, pH 7,5, Tween 20 0,3%) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lặp lại một lần;
Ủ màng với dung dịch đệm U4 (Tris-HCl 0,1M pH 9,5; NaCl 0,1M ) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Phát hiện đầu dò
Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase. Quá trình ủ tránh ánh sáng. Quan sát kết quả sau 30 - 60 phút.
2.2.4. Quá trình lai điểm ngược
2.2.4.1. Hoạt hóa màng nylon (Pall)
Chuyển màng vào dung dịch EDC 16%, lắc nhẹ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng; Tráng nhẹ màng với nƣớc và để khô màng.
2.2.4.2. Cố định đầu dò trên màng nylon (Pall)
Đầu dò oligo (Bảng 4) đƣợc pha loãng đến nồng độ 100 nM trong đệm NaHCO3/Na2CO3 0,5M, pH 8,4;
Chấm 2 µl đầu dị đã pha loãng lên màng, để khô 15 phút, cố định bằng NaOH 0,5 N trong 1 phút.
2.2.4.3. Tiền lai và lai
Tiền lai: chuyển màng vào đệm lai H3 (SSC 2x; SDS 0,1%) trong 30 phút ở nhiệt độ lai;
Biến tính đoạn gen β-globin đánh dấu biotin trong đệm lai H3: bổ sung 45 µl sản phẩm PCR với cặp mồi CD F/R (bổ sung biotin-11-dUTP) vào 100 µl đệm lai, ủ 950
Cho sản phẩm biến tính vào 1,5 ml đệm lai H3. Chuyển màng sang dung dịch này và duy trì ở nhiệt độ lai trong 60 phút;
Rửa màng để loại bỏ đầu dò dƣ thừa: chuyển màng vào dung dịch rửa W2 (SSC 2x) ở nhiệt độ lai trong 5 phút.
2.2.4.4. Phát hiện đầu dò đánh dấu biotin "Khóa" màng "Khóa" màng
Rửa màng với đệm U5 (Tris-HCl 0,1M pH 7,5; NaCl 0,15M) trong 1 phút ở nhiệt độ phòng;
Ủ màng với dung dịch 5x Denhardt (pha loãng từ dung dịch Denhardt 50x trong đệm U5) trong 30 phút ở nhiệt độ lai.
Gắn đầu dò với SA-AP
Pha loãng SA-AP trong đệm U5 (SA-AP : đệm U3 = 1: 5000). Chuyển màng vào dung dịch này trong 30 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng;
Sau khi loại bỏ dung dịch trên, chuyển màng vào đệm U5 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lặp lại một lần;
Ủ màng với dung dịch đệm U2 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Phát hiện đầu dò
Thêm cơ chất của enzyme Alkaline phosphatase và ủ màng trong tối. Quan sát kết quả sau 30 - 60 phút.
2.2.5. Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm
ADN đƣợc tách chiết từ mẫu máu ngƣời bệnh thalassemia bằng kit ReliaprepTM Blood gADN MiniPrep System (Promega). Quy trình gồm các bƣớc chính nhƣ sau:
Mẫu máu bảo quản ở -800C đƣợc lấy ra để tan hoàn toàn, trộn đều nhẹ nhàng trong 10 phút
Chia 20 µl Proteinase K vào các ống eppendorf 1,5 ml Thêm 200 µl máu vào mỗi ống
Thêm 200 µl đệm Cell lysis, trộn đều và ủ 10 phút ở 560C Bổ sung 250 µl đệm Binding, trộn đều
Chuyển hỗn hợp lên cột. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch
Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 500 µl dung dịch Column Wash. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 3 phút, loại dịch. Lặp lại bƣớc này 2 lần
Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml. Thêm 200 µl H2O và ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu dịch chứa ADN. Bảo quản ở -200C.
2.2.6. Tách plasmid
Quy trình tách chiết plasmid gồm các bƣớc cơ bản sau:
Ly tâm (6000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút) 1,5 ml dịch nuôi tế bào bão hòa qua đêm rồi loa ̣i bỏ di ̣ch trong
Hòa tan cặn tế bào trong 100 µl dung dịch I (Tris-HCl 25 mM pH 8, glucose 50 mM, EDTA 10 mM pH 8) có bổ sung RNase 20 µg/ml, ủ 15 phút ở nhiệt đơ ̣ phòng
Thêm 200 µl dung dịch II (NaOH 0,2 N, SDS 1%), trộn nhe ̣, ủ trên đá trong 3 phút
Thêm 150 µl dung dịch III (CH3COOK 3M pH 5,2), trộn nhe ̣, ủ trên đá trong 5 phút
Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25: 24 : 1), trơ ̣n nhe ̣ Ly tâm 13000 vịng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu tủ a
Rƣ̉a tủa bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 vịng/phút ở 40C trong 5 phút, thu tủa và làm khơ tủa
Hịa tủa trong 30µl H2O, bảo quản ở -200C.
2.2.7. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit High pure PCR cleanup micro (Roche)
Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng kit gồm các bƣớc chính nhƣ sau:
Cắt băng ADN từ gel agarose đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml và cân khối lƣợng miếng gel
Bổ sung 300 µl đệm Bingding cho mỗi 100 mg gel. Ủ ở 560
C trong 10 phút Bổ sung 100 µl đệm Binding Enhancer cho mỗi 100 mg gel, trộn đều
Chuyển hỗn hợp lên cột và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để bỏ hết dịch qua cột
Thêm 400 µl đệm Wash, ly tâm 13000 vịng/phút trong 1 phút, bỏ dịch Thêm 300 µl đệm Wash, ly tâm 13000 vịng/phút trong 1 phút, bỏ dịch
Thêm 20 µl H2O vào giữa cột và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu lấy phần dịch. Bảo quản ở -200C.
2.2.8. Phương pháp điện di
Điện di là phƣơng pháp phổ biến để phân tách các phân tử axit nucleic. Dƣới tác dụng của điện trƣờng một chiều, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng nhờ có nhóm phosphat tích điện âm. Các phân tử ADN đƣợc phân tách dựa vào kích thƣớc
và cấu hình. Có hai loa ̣i gel đƣợc dùng phở biến là agarose và polyacrylamide (Bảng 6). Hai loại gel này đƣợc dùng để điện di ADN trong đệm TBE 1x (Tris base, Axit boric, EDTA). Các băng ADN đƣợc phát hiện dƣớ i tia tƣ̉ ngoa ̣i sau khi nhuô ̣m với ethidium bromide.
Bảng 6: Thành phần gel polyacrylamide 8% dùng trong phân tách ADN Thành phần Thể tích (ml) H2O 3,135 TBE 10x 0,5 Bis-acrylamide 30% 1,33 APS 10% 0,035 TEMED 0,005 Tổng số 5
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
A - KẾT QUẢ
3.1. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM
3.1.1. Kết quả khuếch đại và đánh dấu đầu dò M
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng plasmid pTZ57-M chứa đoạn chèn M để làm đầu dị. Đoạn M có trình tự 75 bp đƣợc lặp lại ba lần (Hình 8). Trình tự 75 bp giống hệt với một phần trình tự của đoạn C và sai khác 7 nucleotide với đoạn T. Với đặc điểm nhƣ vậy, đoạn M đƣợc chọn làm đầu dò để phân biệt đoạn C và đoạn T bằng kỹ thuật lai điểm. Đoạn M đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR với khuôn là plasmid pTZ57-M, cặp mồi vector M13 F/R cùng thành phần và điều kiện trình bày trong Bảng 7.
Bảng 7: Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đầu dị M Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n
H2O 11,3 Biến tính lần đầu: 940 C trong 3 phút Lặp lại 45 chu kỳ: Biến tính : 940 C trong 30 giây Gắn mồi : 620 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 10x (15mM Mg2+ ) 1,5 dNTP 2 mM mỗi loại 0,5 M13 F 10 µM 0,25 M13 R 10 µM 0,25
JumpStart Taq ADN
polymerase 2,5 u/µl 0,2 ADN khn 10 - 20 ng Tởng thể tích 15,0
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8%. Kết quả trên Hình 10 cho thấy chúng tôi thu đƣợc băng ADN khoảng 380 bp. Đây là kích thƣớc đoạn ADN gồm đoạn chèn M cộng với khoảng cách giữa hai mồi M13 F và M13 R. Điều đó chứng tỏ chúng tơi đã khuếch đại đƣợc đoạn M.
Chúng tôi thực hiện phản ứng PCR để đánh dấu đầu dò M sử dụng nucleotide gắn chất đánh dấu biotin hoặc digoxigenin (DIG). Với điều kiện chu trình nhiệt khơng đổi nhƣng bổ sung thêm biotin-11-dUTP (hoặc DIG-11-dUTP) so với dTTP theo tỷ lệ tƣơng ứng trong Bảng 8, chúng tơi thu đƣợc kết quả trình bày trên Hình 10A và Hình 10B.
Bảng 8: Thành phần và điều kiện tối ƣu phản ứng đánh dấu đầu dò M với biotin và DIG Thành phần Biotin (µl) DIG (µl) Điều kiê ̣n
H2O 9,8 9,8 Biến tính lần đầu: 940 C trong 3 phút Lặp lại 45 chu kỳ: Biến tính : 940 C trong 30 giây Gắn mồi : 620 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C, 5 phút Đệm 10x (15mM Mg2+ ) 1,5 1,5 d(A, C, G)TP 1mM mỗi loại 1,0 1,0 dTTP 1mM 0,6 0,65 Biotin-11-dUTP 1mM 0,4 DIG-11-dUTP 1 mM 0,35 M13 F 10 µM 0,25 0,25 M13 R 10 µM 0,25 0,25
JumpStart Taq ADN
polymerase 2,5 u/µl 0,2 0,2 ADN 10 - 20 ng 10 - 20 ng Tởng thể tích 15,0 15,0
Đoạn M đƣợc đánh dấu có kích thƣớc cao hơn đoạn M khơng đánh dấu vì khối lƣợng phân tử của biotin-11-dUTP (927.6 Da) và DIG-11-dUTP (1090.7 Da) lớn hơn dTTP thông thƣờng (548.1 Da). Kết quả điện di trên Hình 10 chứng tỏ chúng tơi đã đánh dấu thành cơng đầu dị M với biotin và DIG.
Hình 10: Kết quả đánh dấu đầu dị M với biotin (A) và DIG (B). Giếng 1 và 3: lần
lƣợt là đầu dò M đánh dấu biotin và DIG; Giếng 2: đoạn M không đánh dấu; Giếng M: thang chuẩn SY 100 bp.
3.1.2. So sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG
Với mong muốn so sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG, chúng tơi chấm 2 µl mỗi loại đầu dò (thu đƣợc từ mục 3.1.1) lên màng nylon. Đồng thời, để kiểm tra độ nhạy của kỹ thuật lai điểm, chúng tơi pha lỗng đoạn M khơng đánh dấu theo dải nồng độ 5 ng/µl, 10 ng/µl, 20 ng/µl, 40 ng/µl, sau đó sử dụng 2 µl mỗi nồng độ để chấm lên màng. Các bƣớc trong quy trình lai điểm bao gồm biến tính và cố định ADN trên màng, tiền lai và lai, phát hiện đầu dò đánh dấu biotin và DIG đƣợc tiến hành cụ thể nhƣ đã trình bày trong mục 2.2.3. Chúng tơi thăm dị dải nhiệt độ lai: 550C, 600C, 650C và 700C. Sau khi ủ màng với cơ chất của enzyme alkaline phosphatase (hỗn hợp dung dịch NBT/BCIP) trong tối, chúng tơi quan sát kết quả. Hình 11 minh họa cho kết quả lai điểm ở nhiệt độ lai 600C và 650C. Chúng tôi nhận thấy ở nhiệt độ lai 650C các chấm có tín hiệu rõ ràng hơn cả. Phông màng sạch chứng tỏ bƣớc rửa sau lai đã loại bỏ đƣợc đầu dị dƣ thừa bám vào màng. Các vị trí chấm đầu dò đánh dấu biotin và DIG đều lên màu chứng tỏ đầu dò đánh dấu tốt. Ở cả hai nhiệt độ 600
C và 650C hầu nhƣ khơng có sự khác biệt đáng kể giữa hai loại chất đánh dấu biotin (224$/50 µl biotin-11-dUTP, Fermentas) và DIG (227$/25 µl DIG-11-dUTP, Roche). Do đó, để tiết kiệm chi phí, chúng tơi sử dụng biotin để đánh dấu đầu dị trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 11: Kết quả so sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG và kiểm tra độ nhạy
của kỹ thuật lai điểm. 5, 10, 20, 40 ng: nồng độ đoạn M không đánh dấu; M*: đầu dị đánh dấu biotin hoặc DIG.
Kết quả trên Hình 11 cho thấy, khi nồng độ đoạn M không đánh dấu giảm dần thì chấm tƣơng ứng cũng nhạt dần. Ở nồng độ đoạn M thấp nhất trong thí nghiệm này là 5 ng, chúng tơi vẫn quan sát đƣợc tính hiệu rõ nét. Chúng tơi tiếp tục sử dụng nồng độ này cho thí nghiệm lai nhằm phân biệt hai đoạn trình tự đích và trình tự đối chứng.
3.1.3. Chuẩn bị trình tự đích và trình tự đối chứng
Trong quá trình lai điểm, chúng tơi sử dụng hai trình tự ADN để chấm lên màng. Trình tự đích là đoạn C đƣợc tách dịng trong vector pGEM, trình tự đối chứng là đoạn T đƣợc tách dịng trong vector pTZ57. Hai đoạn ADN này có kích thƣớc 150 bp và chỉ sai khác nhau 7 nucleotide phân bố trong 75 bp (Hình 8). Trƣớc tiên chúng tơi ni bão hịa các khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp trong môi trƣờng LB lỏng và tiến hành tách plasmid theo quy trình 2.2.6. Hai loại plasmid này đƣợc dùng làm
khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi CT F/R để khuếch đại đoạn C và đoạn T. Thành phần và điều kiện phản ứng đƣợc trình bày trong Bảng 5 (2.2.2). Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 8% xuất hiện băng khoảng 150 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn C và T (Hình 12). Nhƣ vậy, chúng tơi đã khuếch đại đƣợc trình tự đích và trình tự đối chứng cho kỹ thuật lai điểm.
Hình 12: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn C và đoạn T. Giếng
ĐC: đối chứng âm (khơng có ADN khn); Giếng C: đoạn chèn C; Giếng T: đoạn chèn T; Giếng M: thang chuẩn SY 100 bp.
3.1.4. Kết quả lai điểm phân biệt trình tự đích (đoạn C) và trình tự đối chứng (đoạn T)
Trong thí nghiệm lai điểm nhằm phân biệt đoạn C và đoạn T, chúng tơi chấm lên màng 2 µl (nồng độ 5 ng/µl) các sản phẩm nhƣ sau: sản phẩm PCR đoạn C và đoạn T (150 bp), đầu dò M đánh dấu biotin (dùng để kiểm tra hiệu quả đánh dấu), đoạn M không đánh dấu biotin (dùng để kiểm tra tồn bộ q trình lai). Sau khi chấm các sản phẩm này lên màng, chúng tôi tiến hành các bƣớc theo mục 2.2.3, sử dụng nhiệt độ lai 650C nhƣ đã thử nghiệm ở mục 3.1.2. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên Hình 13.
Quan sát Hình 13 chúng tơi nhận thấy vị trí chấm đầu dị M khơng đánh dấu và có đánh dấu biotin cho tín hiệu rõ ràng chứng tỏ đầu dị đánh dấu tốt và q trình lai diễn ra ở điều kiện phù hợp. Vị trí chấm đoạn C cho tín hiệu màu chứng tỏ đoạn C đã lai với đầu dò M. Trong khi đó, vị trí chấm đoạn T khơng xuất hiện màu,
chứng tỏ sau q trình lai và rửa khơng có sự bắt cặp bổ sung giữa trình tự này và đầu dị M. Nhƣ vậy, chúng tơi đã tối ƣu đƣợc điều kiện để phân biệt đoạn C và đoạn T bằng kỹ thuật lai điểm.
Hình 13: Kết quả lai điểm phân biệt đoạn C và đoạn T ở 650C. T: vị trí chấm sản phẩm khuếch đại đoạn T; C: vị trí chấm sản phẩm khuếch đại đoạn C; +: vị trí chấm đầu dị M đánh dấu biotin; -: vị trí chấm đoạn M khơng đánh dấu biotin. Để kiểm tra khả năng phát hiện sự có mặt đoạn C trong hỗn hợp các đoạn ADN khác, chúng tôi trộn sản phẩm khuếch đại đoạn C với đoạn ADN ngoại lai bất kỳ (theo tỷ lệ 1:1). Trong thí nghiệm này, chúng tơi lựa chọn đoạn ADN ngoại lai (kích thƣớc 700 bp) là sản phẩm của phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R, sử dụng khuôn là ADN tách từ mẫu máu (mục 2.2.5). Mẫu ADN ngoại lai này đƣợc kí hiệu là In700. Mẫu trộn đoạn C với In700 đƣợc kí hiệu là C700. Ngồi ra, trình tự đoạn C và đoạn T cịn có mặt trong hai plasmid pGEM-C và pTZ57-T. Từ đó, chúng tơi quyết định sử dụng cả hai loại ADN plasmid này (kí hiệu pC và pT) cùng chấm lên màng với các mẫu khác là đoạn T, đoạn C, đoạn In700, mẫu trộn C700. Tiến hành