Sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin

Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

A- KẾT QUẢ

3.2. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM NGƢỢC

3.2.1. Sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin

Sử dụng kit tách ADN tổng số ReliaprepTM Blood gDNA MiniPrep System (Promega), chúng tôi thu đƣợc ADN tách chiết từ mẫu máu ngƣời bệnh thalassemia. ADN này đƣợc dùng làm khuôn trong phản ứng PCR đa mồi để sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin. Trong phạm vi luận văn này, chúng tôi lựa chọn ba đột biến phổ biến nhất gây bệnh β-thalassemia ở ngƣời Việt Nam, bao gồm đột biến tại Cd 17 [A → T], Cd 26 [G → A]) và Cd 41-42 [-TCTT]). Đột biến tại Cd 17 và Cd 26 là những đột biến điểm, tức là trình tự đột biến và trình tự bình thƣờng chỉ sai khác nhau một nucleotide. Điều này gây cho chúng tơi khơng ít khó khăn trong q trình chuẩn hóa phản ứng PCR đa mồi để tránh hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm tính giả. Sau khi thay đổi lƣợng mồi, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, thời gian tổng hợp, chúng tơi đã tối ƣu hóa đƣợc điều kiện PCR đa mồi (Bảng 9).

Bảng 9: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc đồng thời đột

biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n

H2O 7,2 Biến tính lần đầu: 950 C trong 3 phút Lặp lại 35 chu kỳ: Biến tính : 950 C trong 30 giây Gắn mồi : 680 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 5x 3,0 MgCl2 25 mM 0,9 dNTP 2 mM mỗi loại 1,0 CD F 10 µM 1,0 17 MR 10 µM 0,2 26 MR 10 µM 0,1 41-42 MR 10 µM 0,3 CD R 10 µM 0,4

GoTaq Flexi ADN

polymerase 5 u/µl 0,1

ADN 20 - 50 ng

Tởng thể tích 15,0

Trong phản ứng PCR đa mồi, chúng tôi thiết kế cặp mồi nội kiểm CD F/R khuếch đại vùng chứa ba đột biến nghiên cứu và cho sản phẩm có kích thƣớc 700 bp. Việc sử dụng cặp mồi này giúp chúng tôi (1) kiểm tra chất lƣợng ADN tách chiết, (2) kiểm tra thao tác và thành phần trong phản ứng PCR. Các mồi 17 MR, 26 MR, 41-42 MR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đột biến tại codon tƣơng ứng (Hình 17). Ba mồi đột biến này kết hợp với mồi CD F để tạo ra sản phẩm PCR có kích thƣớc lần lƣợt là 200 bp (đột biến tại Cd 17), 220 bp (đột biến tại Cd 26) và 400 bp (đột biến tại Cd 41-42). Chúng tôi sử dụng phản ứng PCR đa mồi để sàng lọc đột biến trên 30 mẫu bệnh phẩm (từ T1 đến T30). Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 2%, chúng tơi thu đƣợc kết quả thể hiện trên Hình 18.

Hình 17: Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong phản ứng PCR đa mồi.

Hình 18: Kết quả điện di sản phẩm PCR đa mồi. Giếng ĐC: đối chứng âm (khơng có ADN

khn); Giếng 1-30: mẫu T1-T30; M: thang chuẩn ADN 100 bp (Fermentas).

Quan sát Hình 18 chúng tơi nhận thấy tất cả các mẫu đều xuất hiện băng 700 bp chứng tỏ ADN tách chiết đạt chất lƣợng và thao tác PCR đảm bảo độ tin cậy. Trong tổng số 30 mẫu có 15 mẫu khơng đột biến, 10 mẫu đột biến đơn và 5 mẫu đột biến kép (Bảng 10).

Bảng 10: Kết quả sàng lọc đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên 30 mẫu bệnh

phẩm bằng phản ứng PCR đa mồi

Kết quả PCR đa mồi Loại đột biến Tên mẫu

Không đột biến T1, T3, T7, T8, T10, T11, T13, T16, T18, T20, T21, T22, T26, T27, T28 Đột biến đơn Cd 17 T2, T4, T19, T30 Cd 26 T25, T29 Cd 41-42 T5, T6, T12, T17 Đột biến kép Cd 17 và Cd 26 T14 Cd 17 và Cd 41-42 T9, T15, T24 Cd 26 và Cd 41-42 T23

Để khẳng định chắc chắn hơn về tính chính xác của các mồi thiết kế, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên mẫu T9 (đột biến kép tại Cd 17 và Cd 41-42) để xác định trình tự. Trƣớc tiên, chúng tơi sử dụng ADN tổng số của mẫu T9 làm khn trong PCR khuếch đại trình tự 700 bp của gen β-globin bằng cặp mồi CD F/R. Thành

phần và điều kiện phản ứng đƣợc trình bày trong Bảng 11.

Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R khuếch đại

đoạn gen β-globin kích thƣớc 700 bp

Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n

H2O 7,9 Biến tính lần đầu: 950 C trong 3 phút Lặp lại 35 chu kỳ: Biến tính : 950 C trong 30 giây Gắn mồi : 680 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 5x 3,0 MgCl2 25 mM 0,9 dNTP 2 mM mỗi loại 0,5 CD F 10 µM 0,3 CD R 10 µM 0,3

GoTaq Flexi ADN

polymerase 5 u/µl 0,1

ADN 20 - 50 ng

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kit High pure PCR cleanup micro (Roche) và điện di kiểm tra trên gel agarose 2% (Hình 19).

Hình 19: Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR mẫu T9 với cặp mồi CD F/R. Giếng 9:

mẫu T9; Giếng M: thang chuẩn SY 100 bp.

Sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc dùng trực tiếp để xác định trình tự với mồi CD F. Kết quả giải trình tự đƣợc trình bày trong Phụ lục. So sánh trình tự nucleotide thu đƣợc với ngân hàng dữ liệu (Hình 20) cho thấy đoạn ADN nhân từ cặp mồi chúng tôi thiết kế tƣơng đồng với trình tự gen β-globin của ngƣời. Đoạn ADN này

mang đột biến Cd 17: nucleotide A (trên trình tự gốc) thay thế bởi nucleotide T và đột biến Cd 41-42 mất 4 nucleotide TCTT trên gen β-globin. Đây cũng chính là hai đột biến chúng tôi đã phát hiện đƣợc trên mẫu T9 bằng kỹ thuật PCR đa mồi (Hình 18). Kết quả này một lần nữa khẳng định tính chính xác của các mồi dùng trong nghiên cứu. Kết quả sàng lọc đột biến trên các mẫu đảm bảo độ tin cậy, khơng có hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm tính giả. Từ đây chúng tơi dùng một số mẫu đã sàng lọc để thử nghiệm kỹ thuật lai điểm ngƣợc với ba cặp đầu dò đã thiết kế (Bảng 4).

Hình 20: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen khuếch đại bằng cặp mồi CD F/R với ngân

hàng dữ liệu NCBI. Query: Trình tự đoạn 700 bp nhân lên từ mẫu T9 bằng phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R; Sbjct: Trình tự đoạn gen β-globin của ngƣời ; Identities: độ tƣơng

đồng tính theo tỷ lệ % các nucleotide giống nhau trên tổng số nucleotide đƣợc so sánh.

3.2.2. Chuẩn bị và đánh dấu trình tự đích cho q trình lai điểm ngược

Nhƣ đã trình bày ở mục 3.2.1, cặp mồi CD F/R đƣợc chúng tôi thiết kế để khuếch đại vùng tập trung các đột biến phổ biến trên gen β-globin, trong đó có đột biến tại Cd 17 [A → T], Cd 26 [G → A]) và Cd 41-42 [-TCTT]. Sản phẩm thu đƣợc từ phản ứng PCR với cặp mồi CD F/R và ADN tách từ mẫu bệnh phẩm đƣợc chúng tơi sử dụng làm trình tự đích để xác định các đột biến bằng kỹ thuật lai điểm ngƣợc. Để thực hiện đƣợc điều đó, chúng tơi đã thiết kế ba cặp đầu dị tƣơng ứng với ba loại đột biến. Mỗi cặp gồm một đầu dị bình thƣờng (bổ sung với trình tự trên gen β-

globin của ngƣời bình thƣờng) và một đầu dị đột biến (bổ sung với trình tự trên gen β-globin của ngƣời bệnh β-thalassemia). Với mỗi cặp đầu dò nhƣ vậy, kỹ thuật lai

điểm khơng chỉ phát hiện đƣợc trình tự đích có mang đột biến mà cịn có thể phân biệt đột biến đồng hợp và dị hợp.

Trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc, đầu dò đƣợc cố định trên màng trong khi trình tự đích tồn tại "tự do" trong dung dịch đệm lai. Yêu cầu đặt ra là đầu dò phải "bám" đƣợc trên màng, tránh bị rửa trơi bởi các bƣớc (rửa màng, "khóa" màng... ) trong suốt q trình lai điểm ngƣợc. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế đầu dị mang nhóm amin ở đầu 5'. Màng nylon Biodyne C (Pall) sau khi đƣợc hoạt hóa bằng dung dịch EDC 16% sẽ "bộc lộ" các nhóm carboxyl. Cấu trúc amin ở đầu 5' giúp đầu dị hình thành liên kết với nhóm carboxyl, từ đó giúp chúng cố định trên màng.

Trình tự đích (đoạn gen β-globin) đƣợc đánh dấu nhờ phản ứng PCR có mặt biotin-11-dUTP (Bảng 12). Chúng tôi lựa chọn ba loại mẫu để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo, bao gồm mẫu T1 không đột biến; mẫu T2 mang đột biến đơn (đột biến Cd 17), mẫu T5 (đột biến Cd 41-42) và mẫu T25 (đột biến Cd 26); mẫu T9 mang đột biến kép (đột biến Cd 17/Cd 41-42), mẫu T14 (đột biến Cd 17/Cd 26) và mẫu T23 (đột biến Cd 16/Cd 41-42).

Bảng 12: Thành phần và điều kiện phản ứng đánh dấu trình tự đích cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc Thành phần Thể tích (µl) Điều kiê ̣n

H2O 7,9 Biến tính lần đầu: 950 C trong 3 phút Lặp lại 35 chu kỳ: Biến tính : 950 C trong 30 giây Gắn mồi : 680 C trong 20 giây Tổng hơ ̣p: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bƣớc cuối: 720 C trong 5 phút Đệm 5x 3,0 MgCl2 25 mM 0,9

d(A, C, G)TP 1mM mỗi loại 1,0

dTTP 1mM 0,6

Biotin-11-dUTP 1mM 0,4

CD F 10 µM 0,3

CD R 10 µM 0,3

GoTaq Flexi ADN

polymerase 5 u/µl 0,1

ADN 20 - 50 ng

Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8%. Kết quả trên Hình 21 cho thấy chúng tôi đã đánh dấu đƣợc đoạn gen β-globin với biotin. Các sản phẩm đánh dấu đƣợc dùng làm trình tự đích trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc.

Hình 21: Kết quả đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin. Giếng B và N: lần lƣợt là đoạn

gen β-globin đánh dấu và không đánh dấu biotin; Giếng T1-T25: sản phẩm PCR đánh dấu biotin của các mẫu bệnh phẩm. Giếng M: thang chuẩn ADN 100 bp (Fermentas).

3.2.3. Kết quả lai điểm ngược phát hiện đột biến trên gen β-globin

Trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc, phân tử ADN đích (trong nghiên cứu này là đoạn gen β-globin đƣợc khuếch đại nhờ cặp mồi CD F/R) chỉ lai với đầu dị có trình tự tƣơng đồng với nó. Để có thể phân biệt trình tự đột biến và không đột biến, đồng hợp và dị hợp, điều kiện lai đƣợc chuẩn hóa để sự bắt cặp bổ sung chỉ xảy ra khi hai sợi đơn có trình tự tƣơng đồng 100%, tức là có thể phân biệt sự sai khác chỉ một nucleotide.

Trƣớc tiên, chúng tơi chuẩn hóa lƣợng đầu dị sử dụng trong q trình lai điểm ngƣợc. Pha lỗng đầu dị trong đệm NaHCO3/Na2CO3 0,5M pH 8,4 về các nồng độ 10, 20, 50, 100 và 250 nM. Sau đó, 2 µl đầu dị đã pha lỗng đƣợc chấm lên màng và lai với trình tự đích đánh dấu biotin. Hình 22 minh họa kết quả lai điểm ngƣợc sử dụng đầu dị bình thƣờng CD17 N với trình tự đích là mẫu T1 (khơng đột biến) ở nhiệt độ lai 550C. Chúng tôi nhận thấy chấm màu nhạt dần khi nồng độ đầu dò giảm dần. Nồng độ đầu dị thấp nhất cịn quan sát thấy tín hiệu màu là 20 nM. Để dễ dàng quan sát kết quả lai, chúng tôi lựa chọn nồng độ đầu dị 100 nM cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 22: Chuẩn hóa lƣợng đầu dị chấm lên màng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc.

10, 20, 50, 100, 250 nM: nồng độ đầu dò CD17 N.

Với nồng độ đầu dò 100 nM và nhiệt độ lai 550C, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm từng cặp đầu dò. Mỗi cặp đầu dò gồm đầu dò đột biến và đầu dò bình thƣờng. Nhƣ đã trình bày ở mục 3.2.2, chúng tôi lựa chọn các mẫu mang đột biến đơn bao gồm mẫu T2 (đột biến tại Cd 17), T5 (đột biến tại Cd 41-42), T25 (đột biến tại Cd 26) lần lƣợt làm trình tự đích trong phản ứng lai với cặp đầu dị CD17 N/M, CD41 N/M, CD26 N/M. Kết quả trên Hình 23 cho thấy ba màng đều xuất hiện màu tại cả hai vị trí chấm đầu dị bình thƣờng (N) và đầu dị đột biến (M), tức là chúng tơi đã ngẫu nhiên lựa chọn đƣợc ba trình tự đích mang đột biến dị hợp tử. Nhƣ vậy, với ba cặp đầu dò đã thiết kế, chúng tôi đã tối ƣu đƣợc các bƣớc trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc để phát hiện đột biến, phân biệt đột biến đồng hợp tử và dị hợp tử.

Hình 23: Kết quả lai điểm ngƣợc phát hiện đột biến trên gen β-globin của từng cặp đầu dò.

Với kết quả khả quan nhƣ trên Hình 23, chúng tơi phát triển kỹ thuật lai điểm ngƣợc để có thể phát hiện đồng thời ba đột biến quan tâm. Sau khi hoạt hóa màng nylon, chúng tơi chấm lên màng ba cặp đầu dị đã thiết kế, mỗi loại 2µl ở nồng độ 100 nM. Trình tự đích đƣợc sử dụng là sản phẩm PCR đánh dấu biotin của mẫu không đột biến T1 và các mẫu mang đột biến kép T9 (đột biến tại Cd 17/Cd 41-42), T14 (đột biến tại Cd 17/Cd 26), T23 (đột biến tại Cd 16/Cd 41-42). Tiến hành các

bƣớc theo mục 2.2.4, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện trên Hình 24. Với mỗi đột biến chúng tơi sử dụng hai loại đầu dị: đầu dị bình thƣờng (CD17 N, CD26 N, CD41 N) và đầu dò đột biến (CD17 M, CD26 M, CD41 M). Màng lai với trình tự đích T1 (khơng đột biến) chỉ xuất hiện các chấm chứa đầu dị bình thƣờng (N). Với trình tự đích T14, chúng tơi thu đƣợc màng lai nhƣ sau: (i) xuất hiện chấm CD17 N và CD17 M chứng tỏ mẫu T14 đột biến dị hợp tử tại Cd 17, (ii) xuất hiện chấm CD26 M (khơng có tín hiệu tại chấm CD26 N) chứng tỏ mẫu T14 đột biến đồng hợp tử tại Cd 26; (iii) xuất hiện chấm CD41 N (khơng lên tín hiệu tại chấm CD41 M) chứng tỏ mẫu T14 không đột biến tại Cd 41-42. Tƣơng tự, mẫu T9 đột biến dị hợp tử tại Cd 17 và Cd 41-42. Mẫu T23 đột biến đồng hợp tử tại Cd 26 và đột biến dị hợp tử tại Cd 41- 42. Những kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả phát hiện đột biến của các mẫu tƣơng ứng bằng phản ứng PCR đa mồi (Hình 18). Điều đó cho thấy chúng tôi đã thiết kế thành cơng các đầu dị và tối ƣu đƣợc điều kiện cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc nhằm phát hiện đột biến tại Cd 17 [A→T], Cd 26 [G→A] và Cd 41-42 [-TCTT] gây bệnh β-thalassemia, đồng thời phân biệt đột biến đồng hợp, dị hợp.

Hình 24: Kết quả lai điểm ngƣợc phát hiện đồng thời ba đột biến trên gen β-globin.

N: đầu dị bình thƣờng; M: đầu dị đột biến.

B - THẢO LUẬN

Các đột biến ở mức độ nucleotide có thể phát hiện đƣợc bằng các kỹ thuật chẩn đoán phân tử. Một số kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến gồm có giải trình tự gen, PCR và lai ADN. Giải trình tự gen là kỹ thuật có độ chính xác cao, phát hiện đƣợc các đột biến mới nhƣng yêu cầu máy móc hiện đại và mẫu phải đƣợc tinh sạch trƣớc khi sử dụng. Nghiên cứu của Wang và cs. vào năm 2003 đã phát hiện đƣợc 16 đột biến phổ biến gây bệnh β-thalassemia ở ngƣời Đông Nam Á và Ấn Độ bằng kỹ thuật giải trình tự [72]. Cũng nhờ kỹ thuật này, Boussiou và cs. lần đầu tiên phát

hiện 6 đột biến hiếm ở ngƣời Hy Lạp, trong đó có một đột biến mới tại Cd 7 [G→T] làm thay đổi bộ ba GAG (Glu) thành mã kết thúc TAG [9]. Kỹ thuật PCR đƣợc áp dụng rất phổ biến với ƣu điểm nhanh chóng, tiết kiệm, phát hiện đƣợc đồng thời một hoặc một vài sai khác. Trong nghiên cứu của Colah và cs. (2009), 6 đột biến phổ biến nhất trên gen β-globin ở ngƣời Ấn Độ đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật PCR đa mồi [13]. Trƣờng hợp các trình tự chỉ thay đổi một nucleotide, việc thiết kế mồi và chuẩn hóa điều kiện cho phản ứng PCR gặp khơng ít khó khăn để tránh hiện tƣợng âm tính giả, dƣơng tính giả. Việc phát hiện đồng thời nhiều đột biến và phân biệt đột biến là đồng hợp hay dị hợp bằng PCR còn bị ảnh hƣởng bởi việc cạnh tranh của nhiều mồi trong cùng phản ứng. Hassan và cs. (2013) thiết lập 6 phản ứng MARMS-PCR (Multiplex Amplification Refractory Mutation System-Polymerase chain reaction) cho 20 đột biến trên gen β-globin ở ngƣời Malaysia, trong đó mỗi

phản ứng có thể phát hiện 1 hoặc 2 hoặc tối đa là 4 đột biến [27]. Kỹ thuật lai điểm và lai điểm ngƣợc có thể khắc phục các giới hạn trên nhƣng các bộ kit thƣơng mại hiện có trên thị trƣờng có giá thành tƣơng đối cao. Với mong muốn tiết kiệm thời gian và chi phí, chúng tơi chủ động thiết lập quy trình lai điểm và lai điểm ngƣợc.

Trƣớc tiên, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp đánh dấu nhờ phản ứng PCR để tạo ra đầu dị một cách nhanh chóng và cho tín hiệu tốt [40]. Chúng tơi sử dụng hai