Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối với kỹ thuật lai điểm dot blot: hai đoạn ADN đích (kí hiệu là đoạn C và đoạn T) có cùng kích thƣớc 150 bp đã đƣợc tách dịng trong hai plasmid: plasmid pGEM-C mang đoạn chèn C và plasmid pTZ57-T mang đoạn chèn T. Hai đoạn chèn này chỉ sai khác nhau 7 nucleotide phân bố trong 75 bp. Đoạn ADN làm đầu dị (kí hiệu đoạn M) đã đƣợc tách dịng trong plasmid pTZ57-M. Đoạn M có kích thƣớc 225 bp gồm đoạn 75 bp lặp lại ba lần trong đó 75 bp này là trình tự có mặt trong đoạn C. Tính tƣơng đồng của các đoạn C, T và M đƣợc trình bày trên Hình 8.
Hình 8: Tính tƣơng đồng của các đoạn C, T và M. Ký hiệu ● thể hiện vị trí sai
- Đối với kỹ thuật lai điểm ngƣợc reverse dot blot: sử dụng 30 mẫu máu của ngƣời bệnh thalassemia (ký hiệu từ T1 đến T30) đƣợc cung cấp bởi Viện Huyết học và Truyền máu Trung ƣơng trong thời gian từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2012.
2.1.2. Hóa chất
- dNTPs (Promega); - MgCl2 (Promega);
- Đệm Taq polymerase 10x (chứa 15mM Mg2+) (Sigma-Aldrich); - JumpStart Taq ADN polymerase (Sigma-Aldrich);
- Đệm Colorless GoTaq Flexi 5x (Promega); - GoTaq Flexi ADN polymerase (Promega); - Biotin-11-dUTP (Fermentas);
- Streptavidin Alkaline phosphatase (Promega); - DIG-11-dUTP (Roche);
- Anti-Digoxigenin Alkaline phosphatase (Roche); - Blocking reagent (Roche);
- Chất hoạt hóa màng nylon Biodyne C: EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) (Sigma-Aldrich);
- Cơ chất cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega);
- Kit tách ADN tổng số từ mẫu máu ReliaprepTM Blood gDNA MiniPrep System (Promega);
- Kit tinh sạch sản phẩm PCR High pure PCR cleanup micro (Roche);
- Các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm và lai điểm ngƣợc đƣợc trình bày trong Bảng 2;
- Các hóa chất thơng dụng khác đều đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Bảng 2: Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm và lai điểm ngƣợc
Dung dịch Thành phần B1 NaOH 0,5M; NaCl 1,5M B2 Tris-HCl 0,5M pH 7,6; NaCl 1,5M H1 SSC 6x; Denhardt 5x; SDS 0,1% H2 SSC 5x; Blocking 1x 10%; SDS 0,1% H3 SSC 2x; SDS 0,1% W1 SSC 2x; SDS 0,1% W2 SSC 2x U1 Tris-HCl 1M pH 7,5; NaCl 1,5M U2 Tris-HCl 0,1M pH 9,5; NaCl 0,1M; MgCl2 0,05M U3 Axit maleic 0,1M, NaCl 0,15M, pH 7,5, Tween 20 0,3% U4 Tris-HCl 0,1M pH 9,5; NaCl 0,1M
U5 Tris-HCl 0,1M pH 7,5; NaCl 0,15M SSC 1x NaCl 0,15M; Natri citrat 0,15M pH 7
Denhardt 1x Ficoll 400 0,02%; Polyvinylpyrrolidone 0,02%; Bovine serum albumin 0,02%
Đệm maleic 1x Axit maleic 0,1M, NaCl 0,15M, pH 7,5
Blocking 1x Blocking reagent 1% (w/v) (pha trong đệm maleic 1x)
2.1.3. Các mồi
Cặp mồi CT F/R khuếch đại đoạn C và T từ plasmid pGEM-C và pTZ57-T. Cặp mồi M13 F/R khuếch đại đoạn M từ vector pTZ57-M (Hình 8). Cặp mồi CD F/R thiết kế dựa trên trình tự gen β-globin công bố trong ngân hàng dữ liệu gen
[81]. Các mồi 17 MR, 26 MR, 41-42 MR dùng trong phản ứng PCR đa mồi để phát hiện các đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin. Các mồi trên đƣợc cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ). Trình tự các mồi đƣợc trình bày trong Bảng 3.
Bảng 3: Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu và kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng Tên mồi Trình tự (5' - 3') Kích thƣớc sản phẩm PCR (bp) CT F TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC 150 CT R CGACGAAACTCCAACGAAAAC M13 F GTAAAACGACGGCCAGT 380 M13 R CGAGAAACAGCTATGAC CD F CCAATCTACTCCCAGGAGCAG 700 CD R CCACACTGATGCAATCATTCG 17 MR ACTTCATCCACGTTCACCTA 200 (với mồi CD F) 26 MR CCAACCTGCCCAGGGCCTT 220 (với mồi CD F) 41-42 MR GGACAGATCCCCAAAGGACTCA 400 (với mồi CD F) 2.1.4. Các đầu dò oligo
Các đầu dò oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc đƣợc gắn thêm nhóm amin ở đầu 5'. Cấu trúc này giúp đầu dị hình thành liên kết với nhóm carboxyl trên màng nylon Biodyne C. Trình tự các oligo đƣợc trình bày trong Bảng 4 và Hình 9.
Bảng 4: Trình tự các đầu dị oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc
(nucleotide gạch chân tƣơng ứng với đột biến)
Tên đầu dị oligo Trình tự (5' - 3')
CD17 N NH2-TGTGGGGCAAGGTGAACGTG CD17 M [A→T] NH2-TGTGGGGCTAGGTGAACGTG CD26 N NH2-AGTTGGTGGTGAGGCCCTGGG CD26 M [G→A] NH2-AGTTGGTGGTAAGGCCCTGGG CD41 N NH2-CCCAGAGGTTCTTTGAGTCC CD41 M [-TCTT] NH2-CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG
2.1.5. Màng lai
- Màng nylon tích điện dƣơng (Nylon membrane, positively charged - Roche); - Màng nylon Biodyne C 0.45µm (Pall).
2.1.6. Thiết bị
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phịng thí nghiệm Sinh Y - Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống và Phịng Genomic - Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.