Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Phân tích di truyền liên kết
1.3.1. Ứng dụng của phân tích di truyền liên kết
Phân tích di truyền liên kết là một cơng cụ hiệu quả trong chẩn đốn bệnh di truyền, nhằm phát hiện gián tiếp tổn thương gen thơng qua nhóm gen liên kết. Một nhóm gen được gọi là có liên kết khi chúng ln được di truyền cùng nhau – hay khơng bị trao đổi chéo trong q trình giảm phân. Thơng qua việc xác định các gen
liên kết với gen bệnh, có thể chẩn đốn các rối loạn đơn gen phức tạp và nhiều dạng như ở bệnh hemophilia A. Quy trình phân tích bao gồm xác định kiểu gen của các thành viên trong gia đình nghi ngờ mang gen bệnh, sau đó thiết lập sơ đồ phả hệ nhằm xem xét sự di truyền của nhóm gen liên kết với gen bệnh.
Trong việc sàng lọc chỉ thị cần chú ý tới vị trí locus chứa chúng để lựa chọn được các chỉ thị nội gen và ngoại gen nằm về cả 2 phía so với gen bệnh để tăng độ tin cậy của kết quả chẩn đốn. Khoảng cách từ chỉ thị đó đến vị trí đột biến cũng là một yếu tố quan trọng, vì những chỉ thị ở xa gen sẽ có tần số tái tổ hợp tăng dần. Tái tổ hợp xảy ra trước lần giảm phân đầu tiên ở các tế bào mầm khi các NST kép trong mỗi cặp tương đồng xếp thẳng hàng nhau. Lúc này, các trình tự DNA tương đồng trên NST từ bố và từ mẹ có thể trao đổi với nhau, q trình này là hiện tượng trao đổi chéo. Phạm vi tái tổ hợp rộng hay hẹp thay đổi ngẫu nhiên dọc theo chiều dài NST, chính vì thế 2 gen càng gần nhau thì khả năng trao đổi chéo của chúng sẽ càng giảm trong suốt quá trình giảm phân hay nói cách khác, tần số tái tổ hợp giữa 2 gen trên cùng NST càng thấp thì chúng càng liên kết chặt chẽ với nhau và càng ở gần nhau. Tần số tái tổ hợp có thể tính từ số cá thể con xuất hiện kiểu hình khác với bố mẹ do quá trình trao đổi chéo các allele khác nhau trên gen.
Mặt khác, chỉ thị càng liên kết tốt với gen có đột biến, khả năng xác định đột biến đó sẽ càng chính xác. Khoảng cách tương ứng với 1% tần số tái tổ hợp là centimorgan (cM). Theo nghiên cứu của Harvey Lodish và cộng sự [46], dựa trên kết quả so sánh khoảng cách vật lý thực tế giữa các gen đã được xác định tần số tái tổ hợp bằng phân tích phân tử, thì trung bình 1 cM ở người tương ứng với khoảng 7,5.105
bp, hay xấp xỉ 1 Mbp. Theo khuyến cáo của Hội sản khoa và Phôi học Châu Âu, khi sàng lọc chỉ thị chỉ nên tiến hành nghiên cứu trong phạm vi từ 1 đến 3 Mbps để đảm bảo độ liên kết giữa chỉ thị và gen cần xác định đột biến [32]. Chính vì thế, trong thiết kế bộ chỉ thị STR nhằm xác định gián tiếp đột biến trên F8, cần đảm bảo các chỉ thị được lựa chọn nằm ở 2 bên gen này để nếu xảy ra hiện tượng trao đổi chéo dù với xác suất nhỏ, vẫn đảm bảo có các chỉ thị được di truyền cùng gen. Ngoài ra, cần chú ý lựa chọn nhiều chỉ thị khi phân tích nhằm hạn chế khả năng mất thông tin do ADO
hay do bản thân một chỉ thị nào đó khơng có thơng tin trong gia đình được chẩn đốn. Với những đặc điểm trên, việc tiến hành nghiên cứu phát hiện gián tiếp đột biến gen F8 thông qua các chỉ thị liên kết với gen này vừa giúp việc chẩn đoán dễ dàng hơn, vừa hạn chế được hiện tượng ADO, đáp ứng yêu cầu của chẩn đoán trước làm tổ. Hơn nữa, kỹ thuật này cịn góp phần kiểm sốt tình trạng nhiễm chéo và ngoại nhiễm trong chẩn đốn trước chuyển phơi hemophilia A.
1.3.2. Chỉ thị phân tử STR
Phương pháp phân tích trình tự lặp kế tiếp (Short tandem repeat – STR) là một trong các công cụ sinh học phân tử hiệu quả nhất được sử dụng rộng rãi trong pháp y, xét nghiệm huyết thống và chẩn đoán bệnh di truyền.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp này là việc so sánh các loci đặc hiệu trong mẫu DNA từ 2 hay nhiều cá thể khác nhau. Cụ thể, một STR là tập hợp 10 – 60 lần lặp lại đoạn trình tự khoảng 2 đến 6 bp, và sự đặc thù ở mỗi cá thể của các STR cho phép nhận biết DNA của từng cá thể hoặc phân tích di truyền liên kết giữa các thế hệ trong cùng một gia đình: thế hệ con sẽ nhận một allele từ bố và một allele từ mẹ; đối với các locus trên X thì con trai chỉ nhận từ mẹ [37]. Sự đặc thù này thể hiện ở số lần lặp của đoạn trình tự, và được phát hiện thơng qua phản ứng nhân gen PCR kết hợp điện di mao quản. PCR giúp nhân bản thông tin từ một lượng nhỏ DNA có trong mẫu sinh phẩm. Sản phẩm nhân STR có kích thước khoảng 100-500bp, và có thể tiến hành PCR đa mồi để nhân bản cùng lúc nhiều đoạn STR, sử dụng các mồi được thiết kế gắn màu huỳnh quang khác nhau và nhân các sản phẩm có kích thước khác nhau.
Mặc dù hệ gen người chứa hàng ngàn chỉ thị STR, nhưng chỉ có một số lượng nhỏ các loci được lựa chọn để sử dụng trong pháp y và các ứng dụng nhận dạng khác [10]. Những loci này được gọi là loci hạt nhân (core loci), cho phép so sánh và nhận dạng di truyền giữa các cá thể. Ngày nay có rất nhiều bộ kit thương mại cho phép tạo các hồ sơ DNA chứa những STR loci hạt nhân này và có hàng triệu hồ sơ STR được tạo trên toàn thế giới bởi các chính phủ, trường đại học, các phịng thí nghiệm nhằm tiến hành nhiều loại xét nghiệm nhận dạng khác nhau bao gồm tạo cơ sở dữ liệu DNA, pháp y, nhận dạng người mất tích hay nạn nhân trong các thảm họa/ đại dịch, hoặc
xét nghiệm huyết thống [11].
Việc sử dụng chỉ thị STR có nhiều ý nghĩa: với tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cá thể (số lần các đoạn lặp có thể khác nhau rất nhiều giữa các cá thể khác nhau), việc kiểm soát nguồn ngoại nhiễm trở nên dễ dàng hơn; kích thước các đoạn lặp khơng q lớn (dưới 500bp) nên chỉ thị STR có thể được nhân bản từ DNA đứt gãy, áp dụng được trên nhiều loại mẫu với chất lượng khác nhau, vì vậy quy trình vận chuyển, bảo quản mẫu cũng thuận lợi hơn so với chẩn đốn trực tiếp bằng các đoạn DNA có kích thước lớn khác [4].
1.3.3. Các chỉ số đa hình di truyền
Các chỉ số đa hình di truyền được tính tốn dựa trên tần số allen thu được từ thực nghiệm, dùng để đánh giá lượng thông tin của một chỉ thị sử dụng trong các thử nghiệm phụ/mẫu hệ (parentage testing). Các chỉ số này bao gồm: tần số dị hợp tử quan sát (Observed Heterozygosity – Ho), tần số dị hợp tử lý thuyết (Expected Heterozygosity – He), và hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content – PIC) [56, 78]. He và PIC càng cao (PIC > 50%) chứng tỏ chỉ thị càng đa hình và có giá trị. Ho quyết định giá trị của chỉ thị đóng góp thơng tin trong chẩn đốn. Ho càng cao, giá trị trong chẩn đoán càng cao. Khi Ho thấp, việc sử dụng các chỉ thị này trong sàng lọc sẽ gây lãng phí về kinh tế, thời gian và cơng lao động.
Đến nay chưa có nhóm nghiên cứu nào xây hệ thống chỉ thị STR liên kết với gen F8 đáp ứng các tiêu chuẩn về chỉ số đa hình PIC và các chỉ số dị hợp tử He, Ho áp dụng cho chẩn đoán trước chuyển phôi bệnh hemophilia A trên quần thể người Việt Nam.