Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5. Kỹ thuật điện di mao quản
Sản phẩm PCR đa mồi có thể phân tích bằng điện di gel agarose hoặc điện di mao quản. Trong ứng dụng để phân tích di truyền liên kết, thường sử dụng điện di mao quản vì với phương pháp này có độ phân giải cao hơn (1 bp) so với điện di gel agarose (khoảng 5 bp).
Hình 11. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản
Nguyên lý của phương pháp là dùng máy điện di có 2 cực: 1 cực âm và 1 cực dương. Sợi DNA mang điện tích âm khi điện di chạy về cực dương, các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ phân tách thành các băng vạch khác nhau. Các cặp mồi để PCR phân tích bằng điện di mao quản được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau gắn vào mồi xuôi (F) hoặc ngược (R), vì vậy sau quá trình PCR sẽ tạo ra các đoạn DNA được gắn các chất phát huỳnh quang tương ứng. Các DNA này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang: các hạt huỳnh quang hấp
thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn) và được camera hay bộ cảm biến ghi lại. Một màng lọc sáng được sử dụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó.
Phương pháp điện di mao quản có nhiều ưu điểm giúp khắc phục những hạn chế của phương pháp điện di thơng thường trong phân tích các chỉ thị STR:
- Thứ nhất: phương pháp điện di mao quản có độ phân giải đến 1 nucleotide. Do vậy, các allele của các STR chỉ cần khác nhau 1 nucleotide cũng có thể phân biệt được.
- Thứ hai: trong phân tích STR, có nhiều STR có kích thước vật lý của các allele (bp) chồng lấn lên nhau. Để phân biệt các STR này, các mồi được gắn huỳnh quang với màu sắc khác nhau ở đầu 5’ của mồi xuôi. Nhờ vậy, sẽ phân biệt được các STR có kích thước các allele chồng lấn. Bằng việc kết hợp phân biệt sản phẩm bằng sự khác nhau về kích thước và màu sắc, kỹ thuật PCR đa mồi có thể được tiến hành với hàng chục cặp mồi trong cùng 1 ống.
- Thứ ba: tín hiệu huỳnh quang được khuếch đại khi bị ánh sáng kích thích, kết hợp hệ thống khuếch đại tín hiệu giúp độ nhạy của phương pháp này rất cao. Yếu tố này giúp q trình nhân gen ở các mẫu có nồng độ thấp, đặc biệt trên mẫu chỉ có 1 bản sao (mẫu một tế bào) khơng địi hỏi số chu kỳ quá lớn, cũng như không cần tiến hành phản ứng PCR lồng (nested PCR) có nhiều nguy cơ nhiễm chéo.
Sau khi khuếch đại các chỉ thị STR tạo ra các sản phẩm huỳnh quang, việc phân biệt sản phẩm (allele) của các loci (STR) dựa vào màu sắc và kích thước của đỉnh tín hiệu huỳnh quang. Kích thước của các đỉnh tín hiệu dựa trên kết quả so sánh với kích thước của thang chuẩn. Chiều cao của các đỉnh tín hiệu thể hiện độ mạnh của tín hiệu huỳnh quang. Trường hợp dị hợp tử, 1 locus (STR) sẽ có 2 allele tương ứng với 2 đỉnh tín hiệu. Trường hợp đồng hợp tử, 1 locus (STR) sẽ có 1 allele, tương ứng với 1 đỉnh tín hiệu trên hình ảnh phân tích kết quả điện di.