STT Tên chỉ thị STR
50 mẫu đối chứng
103 mẫu
mang gen bệnh Tổng 153 mẫu
Ho He PIC Ho He PIC Ho He PIC
1 DXS1073 1 0.78 0.76 0.76 0.86 0.84 0.83 0.86 0.84 2 REN90682 1 0.8 0.78 0.85 0.84 0.82 0.9 0.87 0.86 3 REN90833 0.46 0.67 0.64 0.64 0.77 0.74 0.58 0.85 0.84 4 F8Int25.2 0.98 0.67 0.62 0.67 0.82 0.79 0.76 0.84 0.82 5 F8Int22 0.94 0.67 0.62 0.65 0.77 0.73 0.73 0.76 0.72 6 F8Int21 0.92 0.77 0.74 0.63 0.76 0.72 0.73 0.81 0.78 7 F8Int13.2 0.98 0.78 0.75 0.53 0.83 0.81 0.68 0.85 0.83 8 F8Int1 0.92 0.68 0.63 0.62 0.77 0.74 0.71 0.77 0.74 9 stSG604486 1 0.79 0.77 0.56 0.87 0.85 0.69 0.87 0.86 10 HEMA154130.5 0.98 0.87 0.86 0.82 0.89 0.88 0.87 0.9 0.89 11 THLMEInt2 0.98 0.87 0.86 0.8 0.85 0.84 0.86 0.88 0.87 12 THLMEInt1.1 0.58 0.79 0.77 0.61 0.84 0.82 0.6 0.86 0.84 13 HEMA154498.9 0.98 0.86 0.85 0.75 0.88 0.87 0.82 0.9 0.89
Trên cả 3 tập hợp người mang và không mang gen bệnh, chỉ số PIC của các chỉ thị trong bộ đều đảm bảo cao trên 0,5 – như vậy đột biến trên gen F8 khơng làm ảnh hưởng tới tính đa hình và giá trị thơng tin của các STR liên kết được lựa chọn. Đồng thời qua các biểu đồ cột hình 21-23, có thể thấy các chỉ số tính đa hình cao đồng đều giữa các chỉ thị này và giữa các quần thể người mang và không mang gen bệnh, như vậy tỷ lệ trường hợp cá thể khơng có thơng tin (đồng hợp tử) với cả 13 chỉ thị sẽ là rất thấp, đảm bảo giá trị chẩn đốn trên quần thể quy mơ lớn.
Hình 21. Biểu đồ tần số dị hợp tử quan sát Ho trong các quần thể nghiên cứu
Hình 22. Biểu đồ tần số dị hợp tử lý thuyết He trong các quần thể nghiên cứu
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Tần số dị hợp tử quan sát Ho
50 mẫu đối chứng 103 mẫu mang gen bệnh Tổng 153 mẫu
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Tần số dị hợp tử lý thuyết He
Hình 23. Biểu đồ chỉ số đa hình PIC trong các quần thể nghiên cứu
Ngồi tính đa hình, vị trí các chỉ thị cũng là yếu tố quan trọng quyết định giá trị chẩn đoán: trong trường hợp cá thể có quá nhiều chỉ thị trong bộ ở trạng thái đồng hợp tử, cần ít nhất 01 chỉ thị nằm phía trước (upstream) và 01 chỉ thị nằm phía sau (downstream) gen trong khoảng 1 Mbp để đảm bảo tính liên kết chặt chẽ. Biểu đồ hình 24 thể hiện tỉ lệ cá thể khơng đảm bảo chỉ thị có thơng tin nằm ở cả 2 phía của gen chỉ chiếm khoảng 1% trong quần thể. Như vậy bộ chỉ thị này cũng đáp ứng được yêu cầu về vị trí so với gen F8, và có thể tiến hành chẩn hóa PCR đa mồi để đưa vào quy trình PGT hemophilia A cho quần thể người Việt Nam.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Chỉ số thơng tin đa hình di truyền PIC
Hình 24. Biểu đồ tỉ lệ cá thể dị hợp tử các chỉ thị STR ở 2 bên gen F8
sử dụng trong nghiên cứu 3.1.4. Chuẩn hóa quy trình PGT-M trên mẫu tế bào phơi
Tiến hành phản ứng PCR đa mồi khuếch đại 14 chỉ thị STR liên kết gen F8 trên sản phẩm WGA của 05 mẫu tế bào sinh thiết từ phôi dư 5 ngày tuổi, được đo nồng độ sau WGA bằng máy đo Qubit 4.0 (Thermo) cho kết quả nồng độ DNA đạt yêu cầu phân tích. Thành phần phản ứng và nồng độ mồi đã được tối ưu hóa trước đó.
Bảng 18. Kết quả nồng độ sản phẩm WGA 05 mẫu phơi bào phục vụ tối ưu hóa
STT Tên mẫu Nồng độ DNA sau WGA (ng/µl)
1 NC (đối chứng âm) 0.20 2 1 232.1 3 2 456.2 4 3 450.2 5 4 341.1 6 5 256.5 0.7 0.7 1.3 0.7 2.0 0.7 3.3 3.3 1.3 0.7 3.9 6.5 13.1 13.7 1.3 3.9 7.8 15.7 19.6 -1 0 1 2 3 4 5 6 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Số m arker dị hợp tử upstre am Số marker dị hợp tử downstream
Sản phẩm điện di mao quản phân tích trên phần mềm Genemapper version 4.0 cho hình ảnh kết quả phân tích như sau (các mẫu chạy PCR đa mồi 30 chu kỳ được kí hiệu từ 1.1 – 5.1, các mẫu chạy 40 chu kỳ kí hiệu từ 1.2 – 5.2):
Hình 26. Kết quả tối ưu hóa trên phơi bào 2
Hình 28. Kết quả tối ưu hóa trên phơi bào 4
Các hình ảnh kết quả cho thấy với số chu kỳ là 40, các đỉnh tín hiệu sản phẩm thu được có cường độ tín hiệu cao hơn hẳn so với số chu kỳ là 30. Đồng thời, các sản phẩm xuất hiện đầy đủ và độ phân tách giữa đỉnh sản phẩm chính và tín hiệu nền rõ ràng hơn.
Như vậy, để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác cho phép phân tích áp dụng cho chẩn đốn trước chuyển phơi, số chu kỳ tối ưu cho bước PCR đa mồi là 40 chu kỳ.
3.2. Áp dụng bộ chỉ thị STR thiết kế cho gia đình bệnh nhân hemophilia A 3.2.1. Áp dụng quy trình PGT-M trên gia đình bệnh nhân 3.2.1. Áp dụng quy trình PGT-M trên gia đình bệnh nhân
Gia đình bệnh nhân tình nguyện tham gia nghiên cứu có con trai (kí hiệu mẫu He180916 02-P) được chẩn đốn hemophilia A từ 9 tháng tuổi tại bệnh viên Nhi TW, đến tháng 5/2010 chuyển đến Viện Huyết học – Truyền máu TW khám và làm hồ sơ quản lý. Kết quả xét nghiệm sinh học phân tử tại Viện Huyết học – Truyền máu TW cho thấy người mẹ (kí hiệu mẫu He180916 02-M) mang đảo đoạn intron 22 trên gen F8. Người cha (kí hiệu mẫu He180916 02-F) khơng mang đột biến gen F8.
Cặp vợ chồng nói trên thực hiện IVF tại bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội được 04 phôi. Các phôi bào được sinh thiết từ 04 phơi này (kí hiệu từ He180916 02-Q1 tới He180916 02-Q4), thực hiện WGA và phân tích đột biến gen F8 bằng bộ chỉ thị STR vừa thiết lập, thu được kết quả PGT thể hiện từ hình 30 đến hình 33.
Hình 30. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phơi Q1
Hình 32. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phơi Q3
Hình 33. Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q4
Phôi bào He180916 02-Q1 khơng xuất hiện allele có đỉnh kích thước 145 bp của chỉ thị Amelogenin trên NST Y (Hình 30), như vậy phơi này nhận các STR trên một NST X từ bố và một NST X từ mẹ. Ngồi các allele STR nhận từ bố có kích thước giống với bố (kí hiệu mẫu He180916 02-F), allele STR còn lại giống với bộ allele STR của người con trai bị bệnh (nhận một NST X mang allele F8 gây bệnh từ mẹ). Như vậy, phôi bào He180916 02-Q1 mang allele F8 gây bệnh Hemophilia A và không nên cấy phôi vào tử cung.
Các phôi bào He180916 02-Q2, He180916 02-Q3 khơng xuất hiện allele có đỉnh kích thước 145 bp của chỉ thị Amelogenin trên NST Y (Hình 31-32), như vậy phơi này nhận các STR trên một NST X từ bố và một NST X từ mẹ. Ngồi các allele STR nhận từ bố có kích thước giống với bố (He180916 02-F), bộ allele STR cịn lại khơng giống với bộ allele STR của người con trai bị bệnh (He180916 02-P) mà giống với bộ STR không liên kết với allele F8 gây bệnh của mẹ (He180916 02-M). Như vậy, các phôi bào He180916 02-E2 và He180916 02-E3 không mang allele F8 gây bệnh Hemophilia A và có thể tiến hành chuyển phơi.
Phơi bào He180916 02-Q4 xuất hiện allele có đỉnh kích thước 145 bp của chỉ thị Amelogenin trên NST Y, như vậy phôi này nhận các STR trên một NST X từ mẹ và một NST Y từ bố. Các allele STR nhận từ mẹ có kích thước khơng giống với mẫu He180916 02-P của người con trai bị bệnh. Như vậy, có thể kết luận phơi bào He180916 02-Q4 không mang allele F8 gây bệnh Hemophilia A và cũng có thể tiến hành chuyển phơi.
Như vậy, trong số 04 phơi của gia đình bệnh nhân được áp dụng PGT-M, có 01 phơi mang allele F8 gây bệnh là He180916 02-Q1 (không nên cấy vào tử cung) và 03 phôi không mang allele F8 gây bệnh, có thể cấy vào tử cung là He180916 02- Q2, He180916 02-Q3 và He180916 02-Q4.
Hình 34. Kết quả phân tích di truyền liên kết phục vụ PGT-M hemophilia A của gia đình bệnh nhân tham gia nghiên cứu
Bảng 19. Kết quả phân tích đột biến gen F8 ở phơi IVF
Kí hiệu gia
đình Tổng số phơi Phơi khơng có allele F8 đột
biến Phơi có allele F8 đột biến Phôi WGA thất bại He180916 02 04 03 01 0
3.2.2. Kết quả mang thai và chẩn đốn trước sinh cho gia đình bệnh nhân
Sau khi tiến hành chuyển phơi cho gia đình bệnh nhân, thai phụ được theo dõi và lấy mẫu ối (He180916 02-O) để chẩn đoán trước sinh khi thai nhi đạt 16 tuần tuổi. Kết quả phân tích di truyền liên kết cho mẫu dịch ối sử dụng bộ chỉ thị STR thiết kế được cho thấy thai nhi không mang allele F8 gây bệnh hemophilia A.
Kết quả đối chiếu bằng phương pháp Longrange-PCR thực hiện tại Viện Huyết học - Truyền máu TW cũng cho thấy không phát hiện đảo đoạn intron 22 ở mẫu dịch ối, đồng thời khẳng định thai nhi không mang allele F8 gây bệnh hemophilia A.
Hình 35. Kết quả chẩn đốn trước sinh bằng Longrange PCR do Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương thực hiện
Hình 37. Kết quả chẩn đốn trước sinh bằng phân tích di truyền liên kết sử dụng bộ STR thiết kế được
Như vậy, kết quả phân tích gián tiếp đột biến gen F8 thơng qua các STR đa hình liên kết chặt với gen F8 trước chuyển phôi và trước sinh phù hợp với kết quả phân tích trực tiếp đột biến gen F8 bằng Longrange-PCR (Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương). Nghiên cứu của chúng tôi đã đạt được mục tiêu xây dựng bộ chỉ thị STR đảm bảo tính đa hình cao, liên kết chặt với gen F8, phục vụ chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi hemophilia A và áp dụng thành cơng cho gia đình bệnh nhân.
So với nghiên cứu trước đây ở Việt Nam cũng sử dụng phương pháp phân tích di truyền liên kết với chỉ thị STR để phục vụ PGT-M hemophilia A nhưng khuếch đại chỉ thị bằng PCR đơn mồi [2], nghiên cứu của chúng tơi có thời gian chẩn đốn nhanh và tiết kiệm kinh phí cũng như cơng lao động hơn trong khi vẫn đảm bảo tính chính xác nhờ kỹ thuật PCR đa mồi khuếch đại bộ chỉ thị trong cùng một phản ứng. Khi được áp dụng rộng rãi tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản, quy trình PGT trong nghiên cứu này sẽ góp phần giảm gánh nặng kinh tế cũng như tâm lý cho các gia đình có allele F8 gây bệnh. Các em bé được sinh ra sẽ không cần tiến hành sàng lọc gen bệnh hay tư vấn tiền hôn nhân khi đến tuổi trưởng thành.
Bên cạnh những ưu điểm trên, trong nghiên cứu vẫn có hiện tượng ADO ở một số chỉ thị STR trên các mẫu phơi được tiến hành chẩn đốn. Hình ảnh đỉnh kích thước sản phẩm điện di mao quản của mẫu phơi với tín hiệu khơng cao, hình dạng khơng điển hình cho thấy cần phải kiểm sốt tốt hơn quy trình sinh thiết cũng như vận chuyển mẫu để đảm bảo chất lượng tế bào phơi. Trong giai đoạn áp dụng quy trình PGT cho các gia đình bệnh nhân, khi số lượng phơi được chẩn đốn đủ lớn, cần tiến hành thống kê để loại bỏ các chỉ thị có tỷ lệ ADO quá cao, tiếp tục tối ưu bộ chỉ thị để đảm bảo hiệu quả chẩn đoán.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Đã thiết lập thành công bộ chỉ thị gồm 13 STR đa hình cao và di truyền liên kết chặt chẽ với gen F8, phục vụ chẩn đốn hemophilia A trước chuyển phơi.
2. Đã áp dụng thành cơng quy trình chẩn đốn hemophilia A trước chuyển phôi từ bộ chỉ thị xây dựng được cho 01 gia đình bệnh nhân.
Kiến nghị
1. Mở rộng quy mô nghiên cứu chỉ số đa hình của các chỉ thị STR trong bộ thiết kế được trên các dân tộc khác nhau ở Việt Nam.
2. Áp dụng quy trình PGT-M hemophilia A xây dựng được tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt:
1. Lưu Vũ Dũng (2014), Nghiên cứu xác định đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia
A, Đại học Y Hà Nội.
2. Trần Vân Khánh, Phạm Lê Anh Tuấn, Nguyễn Quý Hoài, Nguyễn Thị Minh, Nguyễn Viết Tiến (2016), "Chẩn đoán tiền làm tổ bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật Microsattlite DNA", Tạp chí nghiên cứu Y Học, pp. 7.
3. Lê Nhật Minh, Võ Thị Thương Lan và Đỗ Trung Phấn (2004), "Sử dụng phương pháp ADN (PCR-RFLP) vùng intron 18 để xác định các cá thể mang gen bệnh máu khó đơng Hemophilia A", Tạp chí Y học thực hành. 8, pp. 61 - 62.
4. Vũ Văn Quỳ (2010), Nghiên cứu tần suất alen của một số locus gen ở người Việt, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
5. Bạch Quốc Tuyên (1991), Nhân một trường hợp Hemophilia A có kháng thể kháng
VIII- Bàn về kháng đông lưu hành, Bài giảng huyết học.
Tài liệu tiếng Anh:
6. Bagnall R., F. Giannelli and P. Green (2005), "Polymorphism and hemophilia A causing inversions in distal Xq28: a complex picture", Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3(11), pp. 2598-2599.
7. Bagnall R. D., N. Waseem, P. M. Green and F. Giannelli (2002), "Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a frequent cause of severe hemophilia A", Blood. 99(1), pp. 168-174.
8. Bogdanova N., A. Markoff, H. Pollmann, U. Nowak‐Göttl, R. Eisert, B. Dworniczak, A. Eigel and J. Horst (2002), "Prevalence of small rearrangements in the factor VIII gene F8C among patients with severe hemophilia A", Human mutation. 20(3), pp. 236-237.
9. Bogdanova N., A. Markoff, H. Pollmann, U. Nowak‐Göttl, R. Eisert, C. Wermes, A. Todorova, A. Eigel, B. Dworniczak and J. Horst (2005), "Spectrum of molecular defects and mutation detection rate in patients with severe hemophilia A", Human
10. Butler J. M. (2006), "Genetics and genomics of core short tandem repeat loci used in human identity testing", Journal of forensic sciences. 51(2), pp. 253-265.
11. Butler J. M. (2007), "Short tandem repeat typing technologies used in human identity testing", Biotechniques. 43(4), pp. Sii-Sv.
12. Castaldo G., V. D'Argenio, P. Nardiello, F. Zarrilli, V. Sanna, A. Rocino, A. Coppola, G. Di Minno and F. Salvatore (2007), "Haemophilia A: molecular insights",
Clinical Chemical Laboratory Medicine. 45(4), pp. 450-461.
13. Chamberlain J. S., R. A. Gibbs, J. E. Rainer, P. N. Nguyen and C. Thomas (1988), "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification", Nucleic acids research. 16(23), pp. 11141-11156.
14. Cooke H. (1976), "Repeated sequence specific to human males", Nature. 262, pp. 182-186.
15. Cora N. I. R., F. I. Delgado, S. M. M. Ramírez and J. V. Quiđones (2017), "Acquired Hemophilia A in an advanced age patient of hispanic origin: a case report",
BMC research notes. 10(1), pp. 438.
16. Cumming A. (2004), "The factor VIII gene intron 1 inversion mutation: prevalence in severe hemophilia A patients in the UK", Journal of Thrombosis and
Haemostasis. 2(1), pp. 205-206.
17. Ding Q., Y. Lu, J. Dai, X. Xi, X. Wang and H. Wang (2012), "Characterisation and validation of a novel panel of the six short tandem repeats for genetic counselling