Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95o C 5 min 1
Kết quả điện di mao quản được phân tích bằng phần mềm Genemapper version 4.0. Việc xác định các đỉnh tín hiệu phù hợp cho mỗi STR dựa trên thang kích thước chuẩn từ cơ sở dữ liệu đã được công bố bởi Machado và cộng sự năm 2009 [47].
2.4.1.6. Tính tốn chỉ số đa hình
Phần mềm Genemapper version 4.0 cho phép hiển thị kết quả điện di mao quản dưới dạng hình ảnh các đỉnh tín hiệu sản phẩm khuếch đại với độ cao của đỉnh tương ứng nồng độ sản phẩm, và kích thước sản phẩm theo bp như minh họa ở hình 15.
Hình 14. Giao diện phân tích kết quả phần mềm Genemapper 4.0.
Sau khi thu thập dữ liệu về kích thước sản phẩm khuếch đại của các mẫu, tiến hành tính tốn các tần số dị hợp tử Ho, He và hàm lượng thơng tin tính đa hình PIC theo các cơng thức cụ thể như sau [31]:
Tần số dị hợp tử quan sát (Observed Heterozygosity – Ho): là tổng tần số các
kiểu gen dị hợp tử quan sát được trong toàn bộ mẫu nghiên cứu.
Ho= Số cá thể dị hợp tử Tổng số cá thể quan sát
Tần số dị hợp tử lý thuyết (Expected Heterozygosity – He):
He=1 -∑Pi2
k
i=1
Trong đó: k là tổng số allele nghiên cứu; Pi là tần số của allele thứ i trong tổng số k allele.
Hàm lượng thơng tin tính đa hình (Polymorphism Information Content – PIC): PIC = 1 -∑Pi2- ∑ ∑2Pi2Pj2 k j=i+1 k-1 i=1 k i=1
Trong đó: Pi, Pi là tần số allele thứ i và j trong tổng số k allele của locus nghiên cứu.
2.4.2. Giai đoạn áp dụng và phân tích di truyền trước chuyển phôi 2.4.2.1. Kỹ thuật ICSI
Kỹ thuật ICSI được thực hiện tại Bệnh viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội với quy trình như sau: bệnh nhân được khám, tư vấn, làm các xét nghiệm cơ bản, và xét nghiệm nội tiết tố sinh dục, siêu âm đếm nang thứ cấp vào ngày 2 của vòng kinh. Hồ sơ được hoàn thành ngay sau khi đủ kết quả, và được duyệt ngay trong tuần. Sau đó, tùy từng trường hợp, bệnh nhân sẽ được kích thích buồng trứng với phác đồ phù hợp [84].
2.4.2.2. Kỹ thuật sinh thiết phôi
Các phôi thụ tinh trong ống nghiệm đạt mốc thời gian 5 ngày tuổi (khoảng 60 tế bào) sẽ được sinh thiết sử dụng tia lase để lấy ra khoảng 3 đến 5 tế bào bởi các chun viên phơi học tại phịng nuôi cấy phôi Bệnh viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội. Các tế bào này sẽ được chuyển về phịng thí nghiệm DNA thuộc Bộ môn Giải phẫu của Học viện Quân Y để kiểm tra bất thường về mặt di truyền. Trước khi chuyển phơi bào ra khỏi phịng ni cấy, phơi bào cần được trải qua bước rửa phôi để loại bỏ các mảnh vụn tế bào vịn sót lại trong q trình sinh thiết cũng như loại bỏ các cặn bẩn trong mơi trường cịn sót lại.
2.4.2.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử
Các kỹ thuật tách DNA, WGA, PCR đa mồi và điện di mao quản được tiến hành tương tự như mô tả ở mục 2.4.1 với các yếu tố nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và số chu kỳ khuếch đại đã được tối ưu hóa.
2.4.2.5. Kỹ thuật phân tích di truyền liên kết trên mẫu phơi
Để kết luận tình trạng phơi, cần so sánh kích thước các STR khuếch đại từ mẫu phôi so với mẫu DNA của bố, mẹ và người thân bị bệnh. Theo nguyên tắc phân tích di truyền liên kết, kích thước STR khuếch đại từ mẫu phôi và DNA của con/ người thân bị bệnh phải phù hợp với kích thước STR khuếch đại từ mẫu DNA của bố và mẹ (các con sẽ được di truyền trực tiếp các STR nằm trên 1 NST X từ bố và 1 NST từ mẹ; trường hợp con trai hoặc phôi mang NST Y sẽ xuất hiện đỉnh sản phẩm 145 bp của marker Amelogenin trên NST Y). Có 2 trường hợp có thể xảy ra:
- Phơi mang gen bệnh: xuất hiện các kích thước STR giống của mẫu con/ người thân bị bệnh nhận từ NST X mang gen bệnh của người mẹ
- Phôi khơng mang gen bệnh: xuất hiện các kích thước STR từ NST X không mang gen bệnh của người mẹ (không xuất hiện ở mẫu con/ người thân bị bệnh).
2.4.3. Giai đoạn xác nhận kết quả bằng chẩn đoán trước sinh
Khi thai phụ mang thai được 16 tuần, tiến hành chọc ối để xác nhận kết quả bằng chẩn đoán trước sinh. Mẫu ối được chia làm 2 phần tương đương nhau:
Một phần được tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử tương tự giai đoạn PGT cùng mẫu máu của các thành viên gia đình và phân tích di truyền liên kết để kết luận tình trạng thai nhi như mơ tả ở mục 2.4.2.5.
Phần còn lại được gửi tới Khoa Di truyền phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu TW để đối chứng bằng phương pháp LD-PCR.
2.4.3.1. Kỹ thuật chọc ối
Thai phụ sẽ được chọc ối dưới hướng dẫn của siêu âm để xác định khoảng cách an toàn cho thai nhi. Nước ối được rút ra qua thành bụng bằng 1 mũi kim rất nhỏ, dài và rỗng. Lượng nước ối được lấy là 10 ml, chia đều vào 2 ống fancol để thuận tiện cho bước tách DNA.
Khi thai phụ mang song thai (2 túi ối), bác sĩ có thể sẽ chọc kim 2 lần vào tử cung để lấy nước ối từ hai buồng ối riêng biệt.
Sau đó thai phụ sẽ được siêu âm kiểm tra lại tình trạng thai nhi sau thủ thuật.
Ly tâm mẫu dịch ối thu được với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi cho tới khi còn lại 1,5 ml trong fancol. Vortex để cặn dưới đáy fancol hòa tan lại đều trong dung dịch còn lại, và tiến hành tách chiết DNA theo như mô tả ở bước 2.4.1.2.
2.5. Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Chỉ số đa hình PIC và các chỉ số dị hợp tử Ho, He của các chỉ thị STR được chọn lọc trong các quần thể: 50 người phụ nữ không mang gen bệnh, 103 người phụ nữ mang gen bệnh, tổng số 153 người phụ nữ mang và không mang gen bệnh Hemophilia A trong quần thể người Việt Nam.
- Quy trình PGT bệnh Hemophilia A sử dụng bộ chỉ thị STR liên kết với gen
F8 thiết kế được.
- Kết quả áp dụng quy trình PGT bệnh Hemophilia A cho gia đình người Việt Nam.
- Kết quả kiểm tra bằng chẩn đốn trước sinh cho gia đình được áp dụng quy trình PGT bệnh Hemophilia A.
2.6. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phịng Phân tích DNA, Bộ mơn Giải Phẫu, Học viện Qn Y. - Thời gian: Từ tháng 9 năm 2017 đến tháng 7 năm 2019.
2.7. Vấn đề y đức và đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành và chấp thuận của Hội đồng y đức trong nghiên cứu y sinh học Học viện Quân Y.
Đối tượng được cung cấp đầy đủ thông tin và tham vấn y khoa trước khi tham gia nghiên cứu. Các đối tượng nghiên cứu có nhu cầu điều trị, chẩn đốn hồn tồn tự nguyện, khơng lựa chọn giới tính. Đối tượng có thể rút khỏi nghiên cứu ở bất cứ giai đoạn nào của tiến trình nghiên cứu. Các nguyên tắc về y đức được đảm bảo thực hiện nghiêm túc.
Trong quá trình thực nghiệm, thu thập, xử lý và báo cáo số liệu, trích dẫn tài liệu đảm bảo trung thực, rõ ràng, khách quan, không đạo văn.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Bộ STR đa hình liên kết với gen F8 phục vụ PGT hemophilia A tại Việt
Nam
3.1.1. Các STR nằm cách gen F8 1Mb
Sau quá trình sàng lọc bằng cơng cụ Tin sinh học kết hợp tham khảo các công bố trên thế giới về chỉ số đa hình của các chỉ thị STR, chúng tôi đã lựa chọn được bộ chỉ thị ban đầu gồm 13 chỉ thị, bao gồm: 03 chỉ thị nằm phía trước gen F8, 05 chỉ thị nằm trong gen F8 và 05 chỉ thị nằm phía sau gen này. Khoảng cách từ các chỉ thị đến gen F8 nằm trong khoảng 1 Mbp, đảm bảo tỷ lệ trao đổi chéo nếu có là dưới 1%. Các STR liên kết với gen F8 sau khi kiểm tra tính đa hình trên quần thể người Việt Nam sẽ được đồng khuếch đại với chỉ thị giới tính Amelogenin để phục vụ quy trình PGT.
Do gen F8 và các chỉ thị liên kết nằm trên NST X, khơng có allele tương ứng trên NST Y, nên việc đồng khuếch đại với chỉ thị giới tính đặc biệt có ý nghĩa khi đánh giá nguyên nhân chỉ thu được 1 đỉnh tín hiệu cho chỉ thị STR nào là do ADO hay do mẫu được phân tích chỉ có 1 NST X. Điều này đồng thời giúp người phân tích kết quả kiểm soát việc phát hiện thiếu allele và nhầm lẫn ký hiệu mẫu các thành viên trong cùng một gia đình.