Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. Kỹ thuật PCR đa mồi
PCR đa mồi là kỹ thuật nhân gen được giới thiệu lần đầu vào năm 1988 trong một nghiên cứu phát hiện mất đoạn gen [13]. Với kỹ thuật này, nhiều trình tự DNA sẽ được khuếch đại cùng lúc, giúp tiết kiệm tối đa thời gian thao tác và chẩn đốn nói chung. Tuy vậy việc thiết kế mồi và tối ưu hóa phản ứng cần được đặc biệt chú trọng
để đảm bảo hiệu suất khuếch đại cho từng đoạn DNA đích là tương đối đồng đều, phục vụ cho bước phân tích được hiệu quả.
Phản ứng PCR đa mồi nói chung có thể chia làm 2 loại:
- PCR đa mồi sử dụng 1 loại khuôn DNA: kỹ thuật này sử dụng một khuôn DNA tổng số với nhiều cặp mồi xuôi và ngược để khuếch đại nhiều vùng đặc hiệu trong một khn đó.
- PCR đa mồi sử dụng nhiều khn DNA: kỹ thuật này sử dụng nhiều khuôn DNA và nhiều bộ mồi trong cùng một ống phản ứng. Sự tồn tại của nhiều mồi có thể dẫn tới bắt cặp chéo giữa các mồi với nhau và khả năng bắt cặp nhầm giữa mồi và khuôn của mồi khác.
Trong việc thiết kết mồi cho PCR đa mồi cần đặc biệt lưu ý tới các thông số sau để đảm bảo hiệu suất phản ứng đạt mức cao nhất:
- Độ dài mồi: phản ứng PCR đa mồi cần số lượng lớn các mồi, vì vậy các mồi được thiết kế phải có độ dài phù hợp. Thơng thường, các mồi với kích thước ngắn, trong khoảng 18 – 22 bp sẽ được sử dụng.
- Nhiệt độ nóng chảy: các mồi với Tm giống nhau, thích hợp nhất là 55°C-60°C thường được sử dụng. Cho các trình tự với tỷ lệ GC cao, khuyến cáo sử dụng các mồi với Tm cao hơn (thường là 75°C-80°C). Khoảng chênh lệch chấp nhận được giữa các mồi trong cùng 1 ống phản ứng là vào khoảng 3°C-5° C.
- Độ đặc hiệu: việc cân nhắc độ đặc hiệu của các mồi được thiết kế cho các trình tự đích là rất quan trọng khi chuẩn bị phản ứng PCR đa mồi, đặc biệt là do sự tồn tại cạnh tranh của các trình tự đích trong cùng 1 ống phản ứng.
- Tránh tạo primer dimer (sản phẩm do các mồi bắt cặp với nhau tạo thành): các mồi được thiết kế phải được kiểm tra việc tạo primer dimer, với tất cả các mồi tồn tại trong cùng hỗn hợp phản ứng. Việc tạo primer dimer sẽ dẫn tới khuếch đại không đặc hiệu.
Ngồi các thơng số trên, những yếu tố khác về cơ bản giống với thiết kế mồi cho PCR thông thường. Với kỹ thuật PCR đa mồi, kỹ thuật viên có thể tiến hành khuếch đại đồng thời các chứng nội để hạn chế âm tính giả, đồng thời tiết kiệm chi
phí hóa chất cũng như thời gian làm thí nghiệm so với việc sử dụng nhiều phản ứng PCR đơn lẻ. Ngoài ra, PCR đa mồi còn cho phép tiến hành xét nghiệm với lượng DNA đầu vào khơng q nhiều (có thể chỉ cần 1 ng hay ít hơn [11]). Với những ưu điểm này, PCR đa mồi được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: phát hiện nguồn bệnh, xác định kiểu gen SNP, phân tích đột biến, phân tích mất gen, định lượng mẫu, phân tích di truyền liên kết, phát hiện RNA, hay lĩnh vực pháp y.