Chƣơng 1 TỔNG QUAN
1.2. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
1.2.3. Marker chọn lọc dùng cho chuyển gen vào nấm
Một loạt các gen thích hợp làm marker chọn lọc ở nấm sợi đã được phát hiện, đóng góp vai trị hết sức quan trọng trong q trình chọn lọc thể chuyển gen mong muốn. Về cơ bản, các marker chọn lọc có thể chia thành 2 loại: gen kháng kháng sinh và gen trợ dưỡng.
Gen kháng kháng sinh
Hai loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chuyển gen hiện nay là hygromycin B và nourseothricin thuộc nhóm aminoglycoside. Kháng sinh hygromycin B nguồn gốc từ Streptomyces hygroscopicus. Hygromycin B ức
chế sinh tổng hợp protein bằng cách tăng cường sự tương tác của tRNA liên kết ở vị trí A của ribosome. Hygromycin B cũng ngăn mRNA và tRNA dịch chuyển bằng cơ chế chưa được xác định. Gen kháng hygromycin B có kích thước 1467 bp, mã
hóa cho hygromycin B phosphotransferase, enzym này chuyển hóa hygromycin B thành 7‖-O-phosphoryl-hygromycin B bằng cách phosphoryl hóa nhóm 4-hydroxyl trên vòng cyclitol. 7‖-O-phosphoryl-hygromycin B thiếu hoạt tính kháng sinh và khơng tương tác với ribosome của tế bào nhân sơ cũng như nhân thực. Gen mã hóa enzym kháng hygromycin B được sử dụng làm marker chuyển gen ở tế bào vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và động vật có vú [76].
Nourseothricin, tên thương mại là clonNAT, được sản sinh bởi xạ khuẩn S.
noursei. Kháng sinh này ức chế quá trình sinh tổng hợp protein bằng cách cảm ứng
lỗi mã hóa. Nourseothricin được sử dụng cho các q trình xóa gen, phục hồi, thay thế và biểu hiện quá mức. Nourseothricin N-acetyltransferase (NAT) là enzym làm bất hoạt nourseothricin bằng cách acetyl hóa nhóm β-amino của gốc β-lysine [9]. Gen mã hóa enzym này được sử dụng làm marker chọn lọc cho quá trình chuyển gen ở một loạt các sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tế bào thực vật [46].
Ngoài ra, nhiều kháng sinh khác cũng được sử dụng cho chọn lọc thể chuyển gen ở nấm như carboxin, geneticin (G418), benomyl, bialophos, phleomycin, bleomycin, ... [17, 86, 110].
Gen trợ dưỡng
Các chủng đột biến trợ dưỡng là các chủng mất khả năng tự sinh tổng hợp một hợp chất cần thiết cho sự sinh trưởng như amino axit, nucleotide, vitamin, ... Do vậy, chúng không thể sinh trưởng trên môi trường tối thiểu như chủng tự nhiên mà cần phải bổ sung thêm hợp chất tương ứng. Các marker trợ dưỡng thường được sử dụng trong chuyển gen ở nấm sợi như pyrG mã hóa enzym tổng hợp
uridine/uracil, adeA mã hóa enzym tham gia tổng hợp adenin, argB mã hóa enzym sinh tổng hợp arginin, niaD mã hóa enzym đồng hóa nitrat, ... [37, 42, 68].
Gen pyrG mã hóa sinh tổng hợp enzym orotidine-5’-monophosphate (OMP) decarboxylase, một trong những enzym quan trọng tham gia vào quá trình sinh tổng
hợp uridine và uracil cần cho sự sinh trưởng của nấm [104]. Các thể đột biến mà gen pyrG bị xóa hoặc bị đột biến gây hỏng sẽ khơng cịn khả năng tổng hợp urdine là tiền chất của uracil, do đó chúng sẽ khơng sinh trưởng được trên mơi trường thiếu uracil/uridine. Các chủng đột biến pyrG có thể được chọn lọc dễ dàng nhờ đặc tính kháng 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [11]. Với chủng tự nhiên (wild type), enzym OMP decarboxylase sẽ chuyển hóa hợp chất 5-FOA thành một chất gây độc tế bào và ức chế sự sinh trưởng của nấm. Ngược lại, các chủng đột biến xóa gen pyrG sẽ
mất khả năng sinh tổng hợp OMP decarboxylase, do đó khơng thể chuyển hóa 5- FOA nên các chủng này có thể sinh trưởng bình thường trên mơi trường chứa 5- FOA có bổ sung uracil hoặc uridine [100]. Chủng nấm bị xóa gen pyrG sẽ dẫn đến kiểu hình trợ dưỡng uracil/uridine, và khi đó gen pyrG nguyên gốc sẽ được sử dụng làm marker cho quá trình chọn lọc các thể chuyển gen. Gen pyrG được đưa trở lại thể đột biến bị hỏng gen pyrG trước đó sẽ giúp thể đột biến có thể tự tổng hợp
uracil/uridine và sinh trưởng được trên môi trường tối thiểu mà không cần bổ sung thêm uracil/uridine.