Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Xóa thành cơng gen stuA ở A niger sử dụng marker trợ dưỡng pyrG
3.3.1. Tạo cấu trúc xóa gen stuA sử dụng marker trợ dưỡng pyrG
Cấu trúc xóa gen stuA ở A. niger sử dụng marker trợ dưỡng được thiết kế dựa trên khung của vector nhị thể pKO2. Gen kháng kháng sinh clonNAT ở vector pKO2 được thay thế bằng cấu trúc biểu hiện gen pyrG của A. oryzae từ vector pEX2B [68].
Marker trợ dưỡng pyrG từ A. oryzae được khuyếch đại sử dụng cặp mồi
giới hạn SpeI và BamHI, sau đó được gắn vào vector pKO2 cũng đã được cắt bằng 2 enzym tương ứng để tạo vector pKO2.1. Sau đó, đoạn 5’ stuA và 3’ stuA lần lượt được nối vào vector pKO2.1 tương tự như quy trình tạo vector xóa gen stuA với
marker kháng kháng sinh. Vector xóa gen được đặt là pKO2.1ΔstuA với vùng T- DNA mang đoạn 5’, một phần rất nhỏ khung đọc mở (ORF) và đoạn 3’ của gen
stuA, nằm giữa hai vùng này là marker trợ dưỡng pyrG từ A. oryzae (Hình 3.7A).
Hình 3.7. Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen stuA ở A. niger sử dụng marker trợ dưỡng (A)
và kết quả xác nhận cấu trúc xóa gen stuA bằng cắt với enzym giới hạn ApaI và
HindIII (B)
Vector pKO2.1∆stuA sau khi tạo được cắt kiểm tra bằng hai enzym giới hạn
ApaI (có một vị trí nhận biết trong gen pyrG của A. oryzae) và HindIII (có một vị trí
nhận biết trong đoạn 5’ stuA và một vị trí nhận biết trên khung vector). Kết quả cắt kiểm tra cho kết quả đúng như tính tốn lý thuyết với 3 băng DNA tương ứng là
1,791 kb; 2,012 kb và 6,928 kb. Điều này chứng tỏ vector pKO2.1ΔstuA dùng để xóa gen stuA ở A. niger dựa trên marker trợ dưỡng pyrG đã được tạo thành cơng
(Hình 3.7B).