Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Phục hồi thành công gen stuA ở chủng xóa gen
3.5.5. Nhiệt độ giúp phục hồi một phần khả năng hình thành bào tử ở chủng A.
niger xóa gen stuA
Cho đến nay, sinh sản vơ tính bằng bào tử vẫn là phương thức sinh sản duy nhất ở A. niger [5]. Bào tử có thể tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt như dưới ánh sáng UV, nhiệt độ cao, điều kiện khô hạn. Một cuống sinh bào tử có thể hình thành hơn 10000 bào tử; điều này giúp A. niger phát tán và phân bố rộng rãi trên toàn thế giới [47, 92, 99]. Tuy nhiên, ở chủng xóa gen stuA, số lượng bào tử hình thành giảm rất mạnh so với chủng tự nhiên, từ một cuống sinh bào tử chỉ hình thành một vài đến vài chục bào tử (Hình 3.13). Sự suy giảm về số lượng bào tử ở thể đột biến xóa gen stuA cũng đã được ghi nhận ở các loài nấm khác như A. nidulans, A. fumigatus,
Acremonium chrysogenum, Fusarium oxysporum, Stagonospora nodorum …. [39,
40, 66, 71, 93]. Bào tử là nguồn nguyên liệu chính được sử dụng trong các nghiên cứu cải biến di truyền sử dụng phương pháp chuyển gen ATMT. Mật độ bào tử thu được thấp sẽ gây khó khăn trong quá trình chuyển gen, lưu trữ và ứng dụng chủng xóa gen trong thực tiễn.
Trong nghiên cứu này, một điểm khá thú vị về vai trò của gen stuA ở A. niger đã được phát hiện. Khi tăng nhiệt độ từ 25°C lên 37°C, khuẩn lạc của chủng
xóa gen stuA chuyển từ kiểu hình màu trắng sang nâu nhạt, đồng thời nồng độ bào tử cũng tăng lên gấp khoảng 2 - 4 lần (Hình 3.14). Như vậy, nhiệt độ ni cấy có thể là tác nhân kích thích sự hình thành bào tử của chủng A. niger xóa gen stuA.
Việc phục hồi kiểu hình tương tự chủng tự nhiên cũng đã được nghiên cứu trên chủng đột biến xóa gen stuA ở nấm Acremonium chrysogenum. Ở loài nấm này,
chủng đột biến xóa gen stuA mất hồn tồn khả năng hình thành bào tử, nhưng hình thái hệ sợi và khả năng hình thành bào tử của chủng xóa stuA có thể được khơi phục về trạng thái tương tự với chủng tự nhiên bằng cách thêm NaCl 0,7 M vào môi trường ni cấy [39].
Hình 3.14. Tăng nhiệt độ giúp phục hồi một phần khả năng hình thành bào tử ở
chủng xóa gen stuA. (A) Hình thái khuẩn lạc của các chủng A. niger ở nhiệt độ 25°C, 30°C và 37°C. (B) Nồng độ bào tử của chủng xóa gen ở 3 điều kiện nhiệt độ
3.5.6. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng axit hóa mơi trường của A. niger
Để kiểm tra sự ảnh hưởng của gen stuA đến khả năng sinh axit hữu cơ dẫn đến axit hóa mơi trường ở nấm A. niger, 1 ml dịch bào tử (nồng độ 106 bào tử/ml) của chủng tự nhiên A. niger N402 (WT), chủng xóa gen stuA (stuA) và chủng
phục hồi (Comp) được cấy vào 50 ml môi trường dịch chiết khoai tây dạng lỏng, pH 7, nuôi lắc ở 200 vịng/phút. Sau 4 ngày ni cấy, dịch ni được ly tâm để loại bỏ sinh khối hệ sợi và bào tử nấm. Kết quả đo pH của dịch nuôi sau ly tâm cho thấy, pH của dịch ni chủng xóa gen stuA là cao nhất (trung bình là 2,84), trong khi pH của chủng tự nhiên và phục hồi lần lượt là 2,085 và 2,13 (Hình 3.15). Như vậy, xóa gen stuA làm giảm khả năng sinh axit hữu cơ ở nấm A. niger. Kết quả cũng cho thấy vai trò quan trọng của gen stuA trong kiểm sốt q trình axit hóa mơi trường ni cấy ở nấm sợi này. Cho đến nay vẫn chưa có cơng trình nào báo cáo về vai trò của gen stuA trong điều hòa sinh tổng hợp axit hữu cơ ở nấm sợi.
Hình 3.15. Khả năng sinh axit hữu cơ của chủng tự nhiên A. niger N402 (WT),
chủng xóa gen stuA (stuA) và chủng phục hồi (Comp)
2,085 2,84 2,13 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 WT ∆stuA Comp G iá tr ị pH
3.5.7. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng sinh enzym cellulase của A. niger
Như kết quả thí nghiệm đã nêu ở mục 3.5.2, kích thước khuẩn lạc của chủng xóa gen trên nguồn cacbon là cellulose nhỏ hơn hẳn chủng tự nhiên và chủng phục hồi (Hình 3.11). Điều này có thể do việc xóa gen stuA đã làm giảm mức độ biểu hiện của gen mã hóa enzym cellulase dẫn tới khả năng sinh trưởng chậm của chủng xóa gen trên nguồn cellulose. Kết quả kiểm tra khả năng sinh enzym cellulase của chủng tự nhiên A. niger N402, chủng xóa gen stuA và chủng phục hồi theo phương pháp của Yang và cộng sự (2016) [116]. Kết quả cho thấy đường kính vịng phân giải cellulose của chủng xóa gen stuA (2,35 cm) nhỏ hơn đáng kể so với chủng tự
nhiên (3,3 cm). Như vậy, việc xóa gen stuA dẫn tới giảm khả năng sinh tổng hợp
enzym cellulase ở A. niger (Hình 3.16). Tuy nhiên chủng phục hồi dùng trong
nghiên cứu này dường như vẫn chưa phục hồi được đặc tính sinh tổng hợp cellulase giống như chủng tự nhiên.
Hình 3.16. Khả năng sinh enzym cellulase của các chủng A. niger
3.5.8. Gen stuA ảnh hưởng đến khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch của A. niger niger
A. niger là lồi nấm hoại sinh có khả năng tiết nhiều loại enzym ngoại bào để
tính hữu ích được khai thác trong sản xuất công nghiệp, A. niger cũng là tác nhân gây hại đối với sản xuất nông sản, đặc biệt là ở giai đoạn sau thu hoạch [26]. Do vậy, ảnh hưởng của gen stuA tới khả năng gây hỏng nho sau thu hoạch của A. niger cũng được đánh giá trong nghiên cứu này.
Nho được rửa sạch và sau đó được khử trùng bề mặt bằng cồn 70%. Nho được làm xước và cấy 10 µl dịch bào tử (nồng độ 106 bào tử/ml) của chủng tự nhiên
A. niger N402 (WT), chủng xóa gen stuA (stuA) và chủng phục hồi (Comp) tại vị
trí vết xước, đối chứng sử dụng nước cất vơ trùng.
Hình 3.17. Khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch của chủng tự nhiên A. niger N402
(WT), chủng xóa gen stuA (stuA) và chủng phục hồi (Comp). (A) Lây nhiễm của các chủng trên nho đã bị làm xước vỏ. (B) Đo đường kính vết hỏng trên bề mặt quả
Sau 9 ngày ủ trong hộp kín, ở 25°C, kết quả so sánh đường kính vết lây nhiễm nhận thấy khả năng gây hỏng nho của chủng xóa gen stuA giảm đáng kể so với chủng tự nhiên và chủng phục hồi, giảm trung bình khoảng 52,33% (Hình 3.20). Rất có thể việc giảm khả năng sinh enzym cellulase và giảm khả năng axit hóa mơi trường có liên quan tới việc giảm khả năng gây hỏng quả ở chủng A. niger xóa gen
stuA.
Việc giảm hoặc mất hẳn khả năng gây bệnh của chủng đột biến xóa stuA đã được cơng bố ở một số loài nấm sợi khác. Stagonospora nodorum là tác nhân gây
bệnh chính trên lúa mì. Thí nghiệm kiểm tra khả năng gây bệnh trên lá lúa mỳ cho thấy tổn thương trên lá gây ra bởi chủng tự nhiên sau 7 ngày vào khoảng 0,7 – 1 cm chiều dài lá, trong khi đó ở chủng đột biến hỏng gen stuA chiều dài tổn thương chỉ vào khoảng 0,16 cm. Sau 14 ngày, chủng tự nhiên gây ra hoại tử màu nâu nhạt trên tồn bộ lá, nhưng ở chủng xóa stuA hiện tượng tổn thương vẫn khơng khác nhiều so với thời điểm 7 ngày [40]. Fusarium culmorum là tác nhân gây bệnh thối rễ trên lúa mì, có thể sản sinh một loạt các độc tố nấm có hại cho sức khỏe con người và động vật. Chủng đột biến xóa gen stuA ở lồi nấm này mất hoàn toàn khả năng gây bệnh với mơ rễ lúa mì [78].
Kết quả của nghiên cứu này cũng cho thấy gen stuA có thể được xem là gen đích tiềm năng ứng dụng trong chiến lược phát triển giải pháp kiểm soát đặc hiệu nấm A. niger nhằm hạn chế khả năng gây hỏng nông sản sau thu hoạch của loài nấm này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Đã tạo thành cơng chủng xóa gen stuA ở A. niger sử dụng hai loại marker
dùng trong chuyển gen là gen kháng kháng sinh clonNAT và gen trợ dưỡng
pyrG với hiệu suất xóa gen lần lượt là 6,52% và 13,83%.
2. Đã tạo được chủng phục hồi biểu hiện gen stuA ở chủng A. niger đột biến đã xóa gen stuA.
3. Đã xác định được cụ thể vai trò của gen stuA ở A. niger trong điều hịa biệt
hóa hình thái tế bào, khả năng hình thành bào tử, khả năng sinh trưởng trên các nguồn cacbon và nitơ khác nhau, khả năng đáp ứng với các stress môi trường, khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase và axit hữu cơ, cũng như khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch.
Kiến nghị
Cần tiếp tục điều tra làm sáng tỏ sự biểu hiện của các gen đích được kiểm soát bởi gen stuA nhờ sử dụng real-time PCR và các cặp mồi đặc hiệu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Khuyến, Võ Thị Hạnh, Phạm Thị Hiển, Mai Thị Đàm Linh, Trần Đức Long, Trần Thị Thùy Anh, Trịnh Tất Cường, Trần Văn Tuấn (2015), "Cải tiến phương pháp tách chiết ADN từ nấm sợi phục vụ chuẩn đoán phân tử phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 31(4S), tr. 167-176.
Tiếng Anh
2. Angelova M. B., Pashova S. B., Spasova B. K., Vassilev S. V. and Slokoska L. S. (2005), "Oxidative stress response of filamentous fungi induced by hydrogen peroxide and paraquat", Mycological research, 109(2), pp. 150-
158.
3. Lazo G. R., Stein P. A. and Ludwig R. A. (1991), "A DNA transformation– competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium", Nature Biotechnology, 9(10), pp. 963.
4. Adams T. H., Boylan M. T. and Timberlake W. E. (1988), "brlA is necessary and sufficient to direct conidiophore development in Aspergillus nidulans", Cell, 54(3), pp. 353-362.
5. Adams T. H., Wieser J. K. and Yu J.-H. (1998), "Asexual sporulation in
Aspergillus nidulans", Microbiology and molecular biology reviews, 62(1),
pp. 35-54.
6. Anastassiadis S. and Morgunov I. G. (2007), "Gluconic acid production",
Recent patents on biotechnology, 1(2), pp. 167-180.
7. Astoreca A., Magnoli C., Ramirez M. L., Combina M. and Dalcero A. (2007), "Water activity and temperature effects on growth of Aspergillus niger, A. awamori and A. carbonarius isolated from different substrates in
8. Baker S. E. (2006), "Aspergillus niger genomics: past, present and into the future", Medical mycology, 44(Supplement_1), pp. S17-S21.
9. Bennett J. W. and Klich M. A. (1992), Aspergillus: biology and industrial applications, Butterworth-Heinemann Boston.
10. Bhavsar K., Kumar V. R. and Khire J. (2011), "High level phytase production by Aspergillus niger NCIM 563 in solid state culture: response
surface optimization, up-scaling, and its partial characterization", Journal of
industrial microbiology & biotechnology, 38(9), pp. 1407-1417.
11. Boeke J. D., La Croute F. and Fink G. R. (1984), "A positive selection for mutants lacking orotidine-5′-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5- fluoro-orotic acid resistance", Molecular and General Genetics MGG,
197(2), pp. 345-346.
12. Borneman A. R., Hynes M. J. and Andrianopoulos A. (2002), "A basic helix–loop–helix protein with similarity to the fungal morphological regulators, Phd1p, Efg1p and StuA, controls conidiation but not dimorphic growth in Penicillium marneffei", Molecular microbiology, 44(3), pp. 621-
631.
13. Breakspear A. and Momany M. (2007), "Aspergillus nidulans conidiation genes dewA, fluG, and stuA are differentially regulated in early vegetative
growth", Eukaryotic cell, 6(9), pp. 1697-1700.
14. Bundock P., den Dulk‐Ras A., Beijersbergen A. and Hooykaas P. (1995), "Trans‐kingdom T‐DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to
Saccharomyces cerevisiae", The EMBO journal, 14(13), pp. 3206-3214.
15. Bundock P., van Attikum H., den Dulk‐Ras A. and Hooykaas P. J. (2002), "Insertional mutagenesis in yeasts using T‐DNA from Agrobacterium tumefaciens", Yeast, 19(6), pp. 529-536.
16. Busby T. M., Miller K. Y. and Miller B. L. (1996), "Suppression and enhancement of the Aspergillus nidulans medusa mutation by altered dosage of the bristle and stunted genes", Genetics, 143(1), pp. 155-163.
17. Chung K.-R., Shilts T., Li W. and Timmer L. (2002), "Engineering a genetic transformation system for Colletotrichum acutatum, the causal fungus of
lime anthracnose and postbloom fruit drop of citrus", FEMS microbiology letters, 213(1), pp. 33-39.
18. Citovsky V., Wong M. L. and Zambryski P. (1989), "Cooperative interaction of Agrobacterium VirE2 protein with single-stranded DNA: implications for the T-DNA transfer process", Proceedings of the National Academy of Sciences, 86(4), pp. 1193-1197.
19. Clutterbuck A. (1969), "A mutational analysis of conidial development in
Aspergillus nidulans", Genetics, 63(2), pp. 317-327.
20. Cole G. T. (1986), "Models of cell differentiation in conidial fungi",
Microbiological reviews, 50(2), pp. 95.
21. Combier J.-P., Melayah D., Raffier C., Gay G. and Marmeisse R. (2003), "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation as a tool for insertional mutagenesis in the symbiotic ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum", FEMS microbiology letters, 220(1), pp. 141-148.
22. Covert S. F., Kapoor P., Lee M.-h., Briley A. and Nairn C. J. (2001), "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Fusarium circinatum", Mycological Research, 105(3), pp. 259-264.
23. Dave K. K. and Punekar N. S. (2015), "Expression of lactate dehydrogenase in Aspergillus niger for L-lactic acid production", PloS one, 10(12), pp.
e0145459.
24. Davidson R. C., Cruz M. C., Sia R. A., Allen B., Alspaugh J. A. and Heitman J. (2000), "Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans", Fungal Genetics and Biology, 29(1), pp. 38-48.
25. De Groot M. J., Bundock P., Hooykaas P. and Beijersbergen A. (1998), "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi",
26. de Vries R. P. and Visser J. (2001), "Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall polysaccharides", Microbiology and molecular
biology reviews, 65(4), pp. 497-522.
27. Deacon J. W. (2013) , Fungal biology, John Wiley & Sons.
28. Degefu Y. and Hanif M. (2003), "Agrobacterium-tumefaciens-mediated transformation of Helminthosporium turcicum, the maize leaf-blight fungus",
Archives of microbiology, 180(4), pp. 279-284.
29. Dhar P. and Kaur G. (2009), "Optimization of different factors for efficient protoplast release from entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae", Annals of microbiology, 59(1), pp. 183.
30. Dijksterhuis J. (2013), Development of Aspergillus niger, The Netherlands: CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre.
31. Dürrenberger F., Crameri A., Hohn B. and Koukolíková-Nicola Z. (1989), "Covalently bound VirD2 protein of Agrobacterium tumefaciens protects the T-DNA from exonucleolytic degradation", Proceedings of the National Academy of Sciences, 86(23), pp. 9154-9158.
32. Gelvin S. B. (2000), "Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration", Annual review of plant biology, 51(1), pp. 223-256. 33. Gimeno C. J. and Fink G. R. (1994), "Induction of pseudohyphal growth by overexpression of PHD1, a Saccharomyces cerevisiae gene related to transcriptional regulators of fungal development", Molecular and Cellular Biology, 14(3), pp. 2100-2112.
34. Harland B. F. and Morris E. R. (1995), "Phytate: a good or a bad food component?", Nutrition Research, 15(5), pp. 733-754.
35. Hoekema A., Hirsch P., Hooykaas P. and Schilperoort R. (1983), "A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the
36. Hooykaas P. and Beijersbergen A. G. (1994), "The virulence system of
Agrobacterium tumefaciens", Annual review of phytopathology, 32(1), pp.
157-181.
37. Horng J. S., Chang P.-K., Pestka J. J. and Linz J. E. (1990), "Development of a homologous transformation system for Aspergillus parasiticus with the
gene encoding nitrate reductase", Molecular and General Genetics MGG,
224(2), pp. 294-296.
38. Howard E. A., Zupan J. R., Citovsky V. and Zambryski P. C. (1992), "The VirD2 protein of A. tumefaciens contains a C-terminal bipartite nuclear
localization signal: implications for nuclear uptake of DNA in plant cells",
Cell, 68(1), pp. 109-118.
39. Hu P., Wang Y., Zhou J., Pan Y. and Liu G. (2015), "AcstuA, which encodes an APSES transcription regulator, is involved in conidiation, cephalosporin biosynthesis and cell wall integrity of Acremonium chrysogenum", Fungal Genetics and Biology, 83 pp. 26-40.
40. IpCho S. V., Tan K.-C., Koh G., Gummer J., Oliver R. P., Trengove R. D. and Solomon P. S. (2010), "The transcription factor StuA regulates central carbon metabolism, mycotoxin production, and effector gene expression in the wheat pathogen Stagonospora nodorum", Eukaryotic cell, 9(7), pp. 1100- 1108.
41. Jesenská Z., Piecková E. and Bernat D. (1993), "Heat resistance of fungi from soil", International journal of food microbiology, 19(3), pp. 187-192. 42. Jin F. J., Maruyama J.-i., Juvvadi P. R., Arioka M. and Kitamoto K. (2004),
"Adenine auxotrophic mutants of Aspergillus oryzae: development of a novel transformation system with triple auxotrophic hosts", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 68(3), pp. 656-662.
43. Jørgensen T. R., Nielsen K. F., Arentshorst M., Park J., van den Hondel C. A., Frisvad J. C. and Ram A. F. (2011), "Submerged conidiation and product formation by Aspergillus niger at low specific growth rates are affected in
aerial developmental mutants", Applied and environmental microbiology,
77(15), pp. 5270-5277.
44. Kado C. I. (2000), "The role of the T-pilus in horizontal gene transfer and