Chƣơng 1 TỔNG QUAN
1.3. Tổng quan về gen stuA
1.3.1. Giới thiệu về gen stuA
Sinh sản vơ tính bằng bào tử là hình thức sinh sản chủ yếu ở nấm sợi [20]. Các gen fluG, brlA, abaA, wetA, medA, stuA và vosA đóng vai trị trung tâm trong
sự hình thành cấu trúc sinh bào tử và bào tử trong chi Aspergillus. Ở A. nidulans, ít nhất bốn gen điều hòa (brlA, abaA, stuA và medA) tham gia điều hịa q trình hình thành bào tử. Sự biểu hiện tuần tự của brlA, abaA và wetA tạo thành con đường cốt lõi cần thiết cho quá trình chuyển từ hệ sợi sinh dưỡng sang bào tử. Locus brlA bao gồm hai đơn vị phiên mã chồng lên nhau, brlAα và brlAβ, mã hóa các protein cần
thiết để bắt đầu con đường này. Các chủng đột biến brlA và abaA mất hoàn tồn khả năng hình thành bào tử. Promoter cảm ứng alcA (alcohol dehydrogenase) của A. nidulans đã được sử dụng để thúc đẩy sự biểu hiện ectopic của brlA trong dịch nuôi
ngập nước (submerged cultures). Dưới những điều kiện này, sự biểu hiện các chức năng đặc hiệu của thể bình thứ cấp đã khiến đỉnh hệ sợi sinh dưỡng nảy chồi và hình thành bào tử. Tuy nhiên, khơng có loại tế bào nào khác của cấu trúc sinh bào tử được tạo thành (tế bào hệ sợi khí sinh, thể bình sơ cấp, thể bình thứ cấp). Do đó, sự biệt hóa tế bào bình thường phải nằm dưới sự điều hòa của các gen khác như
stuA và medA [4].
StuA và MedA điều chỉnh q trình biệt hóa tế bào và tổ chức khơng gian của cấu trúc cuống sinh bào tử một cách chính xác, các chủng đột biến gen stuA và
medA có thể tạo ra bào tử với khả năng sống bình thường [16, 67]. Protein do chúng
mã hóa ảnh hưởng đến biểu hiện của brlA và abaA. StuA điều chỉnh sự biểu hiện của con đường điều hòa cốt lõi bằng cách hạn chế không gian biểu hiện của brlA đến ngoại vi (periphery) của bọng bào tử, thể bình sơ cấp, thể bình thứ cấp và bào
tử chưa trưởng thành và biểu hiện của abaA đến thể bình sơ cấp, thể bình thứ cấp và bào tử chưa trưởng thành [67].
Locus stuA mã hóa hai đơn vị phiên mã chồng lên nhau (stuAα và stuAβ). stuA cần cho q trình biệt hóa tế bào diễn ra bình thường trong suốt quá trình hình
thành bào tử. Đột biến hỏng gen stuA dẫn đến cấu trúc hình thành bào tử bị ngắn lại, khơng có thể bình, bọng bào tử giảm và số lượng nhân bất thường. Chỉ một một số ít bào tử có thể nảy chồi trực tiếp từ bọng bào tử. Như vậy, gen stuA ảnh hưởng đến hình thái của cấu trúc sinh bào tử và mật độ bào tử nhưng không làm thay đổi sự phát triển theo thời gian của các loại tế bào hoặc mật độ cuống sinh bào tử [115].
1.3.2. Vai trò của gen stuA ở nấm sợi
Ở nhiều lồi nấm sợi, vai trị của gen stuA đã được báo cáo là gen liên quan mật thiết đến các quá trình phát triển và biệt hóa tế bào. Gen stuA mã hóa cho
protein thuộc họ protein APSES (Asm-1, StuA, Phd1, Efg1 và Sok2) – các nhân tố phiên mã điều hịa q trình phát triển đặc trưng cho nấm sợi. Trình tự axit amin của chúng rất khác nhau nhưng chúng đều chứa mơ típ cơ sở xoắn – vịng – xoắn (basic helix-loop-helix) có tính bảo thủ cao, gồm khoảng 100 amino axit [33, 107]. Chức năng của protein ASPES khác nhau ở mỗi lồi mặc dù chúng đều có vai trị trong việc điều hịa phương thức sinh trưởng. Ở Neurospora crassa, Asm-1 liên
quan đến nhiều quá trình bao gồm sự nảy mầm của bào tử, tăng trưởng sinh dưỡng và sinh sản hữu tính. Phd1 and Sok2 điều hòa sinh trưởng giả sợi ở Saccharomyces
cerevisiae, Efg1 điều hịa sinh trưởng lưỡng hình và sự hình thành chlamydospore ở Candida albicans. StuA tương đồng nói chung tham gia điều hịa q trình hình
thành bào tử, biệt hóa tế bào, q trình biến đổi hình thái, tăng trưởng sợi nấm và độc lực, nhưng vai trị của chúng thay đổi theo lồi. Ngồi ra, các protein ASPES cịn điều hịa biểu hiện của các gen tham gia vào một số quá trình tế bào như trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp, hình thành các enzym tiết và sinh tổng hợp thành tế bào [5, 12, 71, 96].
Ở A. nidulans, bào tử hình thành thơng qua sự biệt hóa của một loạt các tế bào chuyên hóa: cấu trúc sinh bào tử phát triển từ một nhánh của hệ sợi khí sinh, phồng lên ở đỉnh của nó để hình thành bọng bào tử, thể bình sơ cấp chồi lên từ bọng bào tử, sau đó thể bình thứ cấp chồi lên từ thể bình sơ cấp. Bào tử được hình thành trên đỉnh của thể bình thứ cấp [5]. Đột biến hỏng gen stuA dẫn đến cuống sinh bào tử bị ngắn lại, giảm số bọng bào tử và thiếu thể bình, tuy nhiên đột biến này vẫn hình thành một vài bào tử trực tiếp từ bọng bào tử (Hình 1.7). Điều này cho thấy chức năng của gen stuA là cần thiết từ những sự kiện đầu tiên của quá trình sinh sản vơ tính cho đến khi hồn thành q trình phát triển cấu trúc sinh bào tử. Ngồi ra, đột biến này dẫn đến khiếm khuyết trong quá trình sinh sản hữu tính ở A. nidulans [19].
Hình 1.7. Hình thái cuống sinh bào tử ở A. nidulans hoang dại (WT) và đột biến
stuA 1. CV: bọng bào tử, M: thể bình sơ cấp, P: thể bình thứ cấp, C: bào tử [66]
Ở A. fumigatus, gen stuA tham gia sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Trong số 22 nhóm gen trao đổi chất bậc hai, sáu trong số chúng được phát hiện là phụ thuộc vào gen stuA, bao gồm các nhóm gen sinh tổng hợp gliotoxin,
pseurotin A, fumigaclavin alkaloid và fumitremorgin [103]. Gần đây đã có nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen stuA cần thiết cho sản xuất penicillin V ở Penicillium chrysogenum [95]. Gen stuA cịn liên quan đến sự hình thành bào tử, sinh tổng hợp
chrysogenum [39]. Các đột biến xóa gen stuA ở Fusarium oxysporum có các đặc
điểm kiểu hình phổ biến bao gồm sinh trưởng sinh dưỡng còi cọc, mất tính kỵ nước của sợi nấm, thay đổi sắc tố, giảm hoạt động của enzym polygalacturonic và catalase, thay đổi và giảm sự hình thành bào tử, làm chậm quá trình nảy mầm của bào tử và mất hoàn toàn khả năng gây bệnh đối với mơ rễ lúa mì [71]. Như vậy, có thể thấy gen stuA là một gen điều hịa q trình sinh trưởng và trao đổi chất quan
trọng ở nấm sợi.
Aspergillus niger là một trong những loài nổi tiếng và quan trọng nhất thuộc
chi Aspergillus với các ứng dụng đa dạng trong công nghệ sinh học hiện đại. Nó
được coi là ―nhà máy tế bào‖ sản xuất nhiều loại enzym ngoại bào và axit hữu cơ, điển hình như axit citric [92]. Gen stuA đóng vai trị điều q trình sinh trưởng và các hoạt động trao đổi chất quan trọng ở nhiều loài nấm sợi như đã nêu ở trên. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, vai trị của gen stuA ở nấm sợi A. niger sẽ được làm sáng tỏ thơng qua kỹ thuật xóa gen và phục hồi gen sử dụng phương pháp ATMT. Việc loại bỏ hoàn toàn gen stuA khỏi hệ gen nấm cho phép đánh giá một
cách chính xác vai trị của gen này ở A. niger. Xóa gen stuA được thực hiện với hai loại marker phổ biến dùng trong chuyển gen là gen kháng kháng sinh và gen trợ dưỡng.