Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen
2.2.5.1. Quy trình chung để tạo các vector nhị thể
PCR các đoạn DNA: Trình tự các đoạn DNA được lấy từ cơ sở dữ liệu
Aspergillus Genome Database (http://www.aspergillusgenome.org), các cặp mồi khuếch đại DNA được thiết kế bằng phần mềm Primer3 và được tổng hợp hóa học bởi cơng ty IDT (Singapore). Các đoạn DNA được PCR từ DNA hệ gen sử dụng enzym Phusion® high-fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific). Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,7%.
Xử lý với enzym giới hạn: Các đoạn DNA và plasmid được cắt với enzym
giới hạn dạng FastDigest của hãng Thermo Scientific theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm xử lý enzym giới hạn được điện di trên gel agarose 0,7%; cắt băng tương ứng trên gel và sau đó được tinh sạch bằng kit của hãng Promega hoặc ANABIO R&D JSC theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Nối đoạn DNA vào plasmid (ligation): Đoạn DNA và plasmid sau khi tinh
hướng dẫn của nhà sản xuất. Hỗn hợp phản ứng nối được bọc giấy bạc, ủ ở 4°C qua đêm.
Biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α: hỗn hợp nối qua đêm được biến nạp
vào vi khuẩn E.coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt. Quy trình thực hiện như
sau: rã đơng ống tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả biến trên đá. Hút hỗn hợp nối vào ống tế bào khả biến, trộn nhẹ bằng pipet và ủ 20 phút. Sau đó sốc nhiệt 40 giây ở 42°C và giữ trên đá 1 phút. Bổ sung 800 µl LB lỏng, ni lắc ở 37°C, tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ. Tế bào được thu bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 20 giây và cấy trải trên đĩa môi trường LB chứa kháng sinh kanamycin (100 mg/l), ủ đĩa ở 37°C qua đêm. Các khuẩn lạc mọc trên đĩa sẽ được kiểm tra bằng colony PCR (PCR sử dụng trực tiếp khuẩn lạc vi khuẩn làm DNA khuôn) với cặp mồi đặc hiệu. Các khuẩn lạc có sản phẩm PCR tương ứng với kích thước của đoạn DNA được chèn vào sẽ được dùng để tách plasmid và cắt kiểm tra bằng enzym giới hạn.
Tách plasmid và cắt kiểm tra bằng enzym giới hạn: Nuôi lắc các khuẩn lạc
được chọn trong 20 ml môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin (100 mg/l) qua đêm, tốc độ 200 vòng/phút. Ly tâm 6 ml dịch ni ở 12000 vịng/phút trong 20 giây. Bổ sung 250 µl đệm P1 (50 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 7,6) và 3 µl RNase (10 mg/ml), hịa tan cặn tế bào bằng vortex. Tiếp theo, thêm 250 µl đệm P2 (200 mM NaOH, 1% SDS), đảo ống nhẹ nhàng 5 lần. Sau đó, bổ sung 350 µl đệm N3 (CH3COOK 3M; pH 5,5), đảo ống nhẹ 5 lần. Ly tâm ống ở 4°C, 12000 vòng/phút trong 20 phút. Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới và bổ sung thêm một thể tích isopropanol lạnh. Ly tâm ống ở 4°C, 12000 vòng/phút trong 10’. Đổ bỏ dịch và rửa cặn bằng 500 µl ethanol 70%. Ly tâm ở 4°C, 12000 vòng/phút trong 5’, đổ bỏ dịch. Ống plasmid được làm khô bằng máy cô quay chân khơng SpeedVac và hịa vào 50 µl đệm TE 1x. Plasmid được điện di kiểm tra nồng độ trên gel agarose 0,7%, sử dụng ngay để cắt kiểm tra hoặc bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh.
Thông tin về gen stuA của A. niger được trích xuất từ cơ sở dữ liệu hệ gen Aspergillus (The Aspergillus Genome Database: http://www.aspergillusgenome.org) nhờ sử dụng tính năng tìm kiếm (Search) với thuật ngữ ―stuA‖. Trình tự của gen stuA cùng vùng 5’ và 3’ của gen này được trích xuất tương ứng với dữ liệu của loài A. niger. Trình tự mã hóa của gen stuA được
dịch sang trình tự axit amin để phục vụ cho phân tích cấu trúc và xây dựng cây phát sinh chủng loại. Phân tích cấu trúc của protein StuA bằng InterProScan (https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search). Cây phát sinh chủng loại được xây dựng nhờ phần mềm MEGA6 (sử dụng phương pháp neighbor-joining với giá trị bootstrap là 1000. Các trình tự tương đồng với protein StuA ở các loài nấm khác được lấy từ cơ sở dữ liệu GenBank sử dụng công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) với trình tự protein StuA làm mẫu dị.
2.2.5.3. Tạo vector xóa gen stuA ở A. niger
Cấu trúc xóa gen stuA ở nấm A. niger được thiết kế nằm trong vùng T-DNA của vector nhị thể pKO2 (Bảng 2.1). Hai đoạn DNA được khuếch đại từ DNA hệ gen của chủng nấm A. niger N402 gồm 5’ stuA nằm phía trước khung đọc mở (kích thước 1245 bp) bằng cặp mồi AnstuA-P1/P2 và 3’ stuA nằm phía sau khung đọc mở bằng cặp mồi AnstuA-P3/P4 (kích thước 1102 bp). Phản ứng PCR sử dụng enzym Phusion® high-fidelity DNA polymerase với chu trình nhiệt như sau: 94°C (6 phút); 35 chu kỳ lặp lại các bước 94°C (30 giây), 58°C (30 giây), 72°C (1 phút) và 72°C (10 phút), giữ ở 4°C. Sau khi xử lý với enzym giới hạn và được tinh sạch từ gel agarose, hai đoạn 5’ stuA và 3’ stuA lần lượt được nối vào vector pKO2 (Bảng 2.1) cũng đã được xử lý bằng enzym tương ứng. Đoạn 5’ stuA được nối vào vector tại vị trí nhận biết của enzym EcoRI và SacI, tiếp đó đoạn 3’ stuA được nối vào vector
pKO2 đã mang đoạn 5’ stuA ở vị trí nhận biết của enzym giới hạn BamHI và XbaI. Vector xóa gen được đặt tên là pKO2ΔstuA có kích thước là 10,626 kb; chứa trình tự của gen kháng kháng sinh nourseothricin (clonNAT) nằm giữa 2 đoạn 5’
stuA và 3’ stuA. Vector này được xác nhận lại bằng cách cắt kiểm tra với hai enzym
giới hạn XhoI và HindIII.
2.2.5.4. Tạo vector phục hồi gen stuA ở A. niger
Cấu trúc phục hồi gen stuA ở A. niger được thiết kế dựa trên khung của
vector pGreen2 (Bảng 2.1). Từ DNA hệ gen của chủng A. niger N402, khuếch đại
đoạn DNA bao gồm khung đọc mở (ORF) và terminator của gen stuA (kích thước
3343 bp) sử dụng cặp mồi AnstuA-ORF-F/AnstuA-P4 (Bảng 2.3). Chu trình nhiệt của PCR như sau: 94°C (6 phút); 35 chu kỳ lặp lại các bước 94°C (30 giây), 58°C (30 giây), 72°C (2 phút 20 giây) và 72°C (10 phút), giữ mẫu ở 4°C. Sau khi xử lý với enzym giới hạn XbaI, đoạn DNA được tinh sạch từ gel agarose và nối vào
vector pGreen2 cũng đã được xử lý trước đó với 2 enzym SnaBI và XbaI. Phản ứng nối sử dụng enzym T4 DNA ligase (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cấu trúc được đặt tên là pstuA-P6 và cắt kiểm tra bằng enzym giới hạn
BamHI.