Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.6. Chuyển gen vào nấm sợi A niger thông qua vi khuẩn A tumefaciens
2.2.6.1. Biến nạp vector nhị thể vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1
Các vector nhị thể được biến nạp vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 bằng phương pháp xung điện [98]:
Tạo tế bào AGL1 khả biến: Khuẩn lạc AGL1 tươi được nuôi lắc trong 100 ml
mơi trường LB lỏng ở 28°C, 200 vịng/phút, qua đêm. Ly tâm dịch ni vi khuẩn ở 4000 vịng/phút trong 10 phút ở 4°C, đổ bỏ dịch nổi. Cặn chứa tế bào vi khuẩn được rửa 3 lần bằng HEPES 100 mM, 1 lần bằng glycerol 10% và ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút ở 4°C giữa mỗi lần rửa. Cuối cùng, hòa cặn tế bào trong 1 ml glycerol 10%. Chia 50 µl dịch tế bào khả biến ra mỗi ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, sử dụng ngay để biến nạp hoặc bảo quản ở -30°C.
Biến nạp vector vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 khả biến: 50 µl dịch tế
và đặt trên đá. Quá trình biến nạp sử dụng máy chuyển gen xung điện Bio-Rad với các thơng số 2,5 kV; 400 Ω; 25 µF. Sau khi kích hoạt xung điện, bổ sung vào cuvet 500 µl mơi trường LB lỏng, trộn nhẹ và chuyển hỗn hợp sang ống eppendorf, ni lắc ở 200 vịng/phút, 28°C trong 1 giờ. Tế bào vi khuẩn được thu bằng ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 20 giây và được cấy trải trên môi trường LB bổ sung kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Sau khi ủ 2 ngày ở 28°C, trên đĩa biến nạp xuất hiện các khuẩn lạc kháng kanamycin. Các khuẩn lạc được kiểm tra bằng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu để chắc chắn rằng vi khuẩn AGL1 đã nhận được vector mong muốn.
2.2.6.2. Quy trình chuyển gen vào nấm sợi A. niger thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Khuẩn lạc tươi của vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 mang vector mong muốn được nuôi trong 20 ml môi trường LB lỏng qua đêm ở 28°C. Sau đó, pha lỗng 0,5 ml dịch ni tế bào qua đêm trong 4,5 ml môi trường cảm ứng IM có bổ sung 200 µM acetosyringone (AS), bọc giấy bạc, ni lắc 200 vòng/phút ở 28°C. Sau 6 giờ cảm ứng, OD của dịch nuôi được đo bằng máy đo quang phổ, giá trị OD vào khoảng 0,8. Trải đều hỗn hợp chứa 100 µl của dịch ni đã cảm ứng và 100 µl bào tử nấm (nồng độ 106 bào tử/ml) lên màng cellulose (Satorius, Đức) đã được đặt sẵn trên đĩa môi trường IM có bổ sung 200 µM AS.
Sau khi đồng nuôi cấy trong hộp tối 2,5 ngày ở 20ºC, màng cellulose được chuyển sang đĩa mơi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh hygromycin (300 mg/l) hoặc clonNAT (200 mg/l) để sàng lọc các chủng nấm chuyển gen và kháng sinh cefotaxime (300 mg/l) để tiêu diệt vi khuẩn A. tumefaciens AGL1. Đĩa được ủ ở
nhiệt độ 28-30°C trong khoảng 4-6 ngày để thu nhận các khuẩn lạc nấm chuyển gen.
Các khuẩn lạc nấm xuất hiện riêng rẽ trên đĩa môi trường sàng lọc sẽ được thuần khiết bằng phương pháp cấy ria 3 pha. Sau khi nuôi cấy và tách chiết DNA hệ gen, các khuẩn lạc chuyển gen sẽ được xác nhận bằng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Đối với các chủng xóa gen stuA, các thể đột biến được xác nhận bằng với các cặp mồi đặc hiệu. Đối với các chủng phục hồi gen stuA, các thể chuyển gen
được kiểm tra với 2 cặp mồi đặc hiệu là PgpdA-F/HPH-R và AnstuA-ORF- F/AnstuA-P6 (Bảng 2.3).