2.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư
Tế bào ung thư được nuôi trong môi trường DMEM (Dulbecco’s ModiWed Eagle’s Medium) hoặc RPMI chứa 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% penicillin/Streptomycin, và ủ ở nhiệt độ 37oC trong tủ ổn nhiệt có cung cấp 5% CO2.
2.3.2 Phương pháp tạo khối u trên chuột thí nghiệm
Ni chuột ổn định trong 1 tuần, khối lượng tăng lên khoảng 25-39 gram. Tiến hành chia chuột thành 4 nhóm, mỗi nhóm 5 con, bao gồm:
Nhóm 1 (ký hiệu NIL): chuột hồn tồn khỏe mạnh, khơng gây u cũng như chiếu xạ.
Nhóm 2 (ký hiệu NC): chuột được gây u nhưng không chiếu xạ.
Nhóm 3 (ký hiệu IR): chuột được gây u và chiếu xạ.
Nhóm 4 (ký hiệu IR+MEL): chuột được gây u và bổ sung melanin trước và sau khi tiến hành chiếu xạ. Dựa vào các nghiên cứu trước, khảo sát nồng độ nano-melanin an toàn dùng cho mỗi lần tiêm là 0,2 mL.
Với 3 nhóm chuột được gây u sẽ gây u dưới da bằng cách tiêm dung dịch mang tế bào ung thư 3LL vào dưới da của chuột. Quan sát sự hình thành khối u. Khi khối u đạt tới kích thước phù hợp, tiến hành chiếu xạ đối với các nhóm IR và IR+MEL. Trong quá trình điều trị, trọng lượng chuột và kích thước khối u sẽ được cân đo thường xuyên 3 ngày/lần. Sau thời gian điều trị, chuột sẽ được thu mô khối u, thu mô thường cạnh khối u và thu máu để làm các thí nghiệm phân tích mơ học cũng như các chỉ tiêu hóa sinh và huyết học.
2.3.3 Phương pháp chiếu xạ điều trị khối u trên chuột
Chuột sẽ được chiếu xạ tại Bệnh viện Quân y 103. Chuột sẽ được chiếu xạ tia gamma với thời lượng thích hợp để đạt được các liều lượng chiếu xạ mong muốn. Các liều lượng chiếu xạ dự định sẽ tiến hành là 4, 6 và 8 Gray (Gy) với tốc độ chiếu xạ là 1,0 Gy/min.
2.3.4 Thu mẫu các bộ phận trên chuột
Đầu tiên, chọn đúng con chuột cần thu mẫu. Lấy mẫu máu tĩnh mạch mạch đuôi bằng cách sử dụng kim 23G để chọc ven và máu được thu thập bằng ống mao dẫn hoặc ống tiêm có kim. Trong trường hợp gặp khó khăn, có thể mở 0,5 đến 1 cm bề mặt da tại vị trí tĩnh mạch, chích tĩnh mạch cho chảy máu và thu thập máu bằng ống mao dẫn hoặc ống tiêm có kim. Lưu ý khơng cọ xát đi từ gốc đến ngọn thì vì nó sẽ dần đến tăng bạch cầu. Nếu không nhìn thấy tĩnh mạch, có thể nhúng đi vào nước ấm (40oC). Ống nghiệm chứa EDTA dùng để xét nghiệm huyết học, ống nghiệm chứa heparin dùng để xét nghiệm hóa sinh. Lắc đều sau khi lấy mẫu để tránh làm đông mẫu máu.
Tiếp đó, giữ cố định chuột bằng chân ghim trên khay mổ, đặt chuột nằm ngửa. Sau đó lách nhẹ kéo, cắt lớp da chia đôi chuột ở phần bụng. Tiếp đến lấy pank kéo nhẹ lớp da vừa cắt sang hai bên, dùng ghim cố định. Xác định vị trí hạch, vị trí khối u rồi dùng kéo cắt hạch và khối u ra khỏi lớp da, thu hạch và khối u vào dung dịch PBS. Sau đó lấy kéo cắt dọc cơ thể tại lớp cơ cũng như xương lồng ngực. Nhẹ nhàng kéo tim và phổi chuột lên để lộ tuyến ức bên dưới, thu lấy tuyến ức. Bước tiếp theo xác định gan, lách, thận gần khu vực ruột và thu lại các mẫu gan, lách và thận chuột. Rồi đem cân các mẫu gan, lách và khối u để xác định khối lượng.
Cuối cùng bảo quản các mẫu vừa thu được trong formalin để sử dụng cho các thí nghiệm trong tương lai.
2.3.5 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu huyết học và hóa sinh
Các chỉ số huyết học (số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu, huyết sắc tố, thể tích khối hồng cầu, % tế bào lympho,…) được phân tích trên máy huyết học Unicel DxH 600; các chỉ tiêu hóa sinh (ALT, AST, ure, creatinin) được phân tích trên hệ thống máy xét nghiệm cobas 6000 tại Phòng xét nghiệm của Bệnh viện Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.3.6 Phương pháp phân tích mơ học
Mẫu khối u và mô lành đã thu được tách ra và cố định trong formalin (10%). Sau đó các mẫu mô được loại bỏ canxi bằng cách sử dụng axit formic (5%) và cố định trong parafin. Các mô được cắt lát và cố định trên các phiến thủy tinh. Tiếp đó mẫu mơ được khử parafin bằng xylen và rửa nhiều lần bằng cồn với nồng độ cồn tăng dần (từ 70% - 80% - 90% - 99.9%). Tiến hành nhuộm với hematoxylin/ eosin để tạo tiêu bản mô. Cuối cùng, quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi để đánh giá mức độ phá hủy mô của tia xạ.
2.3.7 Phương pháp phân tích thống kê
Kết quả từ ba lần thí nghiệm lặp lại trong mỗi nhóm sẽ được phân tích thống kê theo chuẩn Student ttest. Phần mềm SPSS (version 18, SPSS Japan Inc.) sẽ được sử dụng cho các phép phân tích thống kê này và mức độ khác biệt có ý nghĩa sẽ được chọn với giá trị p < 0,05.
Chương 3 - KẾT QUẢ