Chương 2 .VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Các phương pháp được nghiên cứu
2.4.1.2. Phương pháp phân lập mẫu bệnh
Từ các mẫu bệnh đã được làm khô sẽ tách lấy một bào tử đơn dưới kính hiển vi bằng kỹ thuật phân lập bào tử đơn M. oryzae, được gọi là chủng phân lập
(isolate). Trước tiên, đoạn lá lúa hoặc cổ bơng có vết bệnh được cắt ra, cho vào ống falcon 15 ml để tiến hành khử trùng:
Ngâm mẫu trong javel 1% trong thời gian 3 phút; Rửa sạch mẫu 4-5 lần bằng nước cất khử trùng;
Chuẩn bị đĩa petri có đặt giấy thấm, bổ sung nước cất đã khử trùng cho thấm ướt giấy thấm, sau đó cấy mẫu vào đĩa.
Đặt đĩa petri vào phòng sáng ở nhiệt độ 26oC cho nấm đạo ôn phát triển bào tử. Sau 1-2 ngày sử dụng kính hiển vi để tách bào tử đơn. Dùng que thủy tinh quết nhẹ vào bề mặt vết bệnh để bào tử bám vào, sau đó đưa sang cấy vào đĩa môi trường agar 3,5%. Sau khoảng 24h, bào tử đơn bắt đầu nảy mầm, dưới kính hiển vi sử dụng dao nhọn để cắt lấy 3 bào tử đơn cấy vào đĩa mơi trường bột gạo có bổ sung kháng sinh penicilline 500000 UI/l để được mẫu nấm thuần.
Sau 7-10 ngày, các bào tử nấm sẽ phát triển hệ sợi. Chọn 1 bào tử đơn phát triển tốt nhất trong số 3 bào tử đơn được cấy,tách sợi nấm chuyển sang mơi trường ni cấy lỏng có kháng sinh, sau 4 ngày sử dụng mẫu cấy để tách chiết DNA (tối, 25oC). Đồng thời với quá trình cấy sợi nấm vào môi trường lỏng để tách DNA, từ cùng một isolate sợi nấm cũng được cấy vào mơi trường rắn có đặt giấy thấm trên bề mặt để nuôi mẫu phục vụ lưu trữ.
Bảng 2.1. Thành phần môi trường bột gạo
Thành phần Khối lượng cho 1L
Agar 15 g
Bột gạo 20 g
Chiết xuất nấm men 2 g
Bảng 2.2. Thành phần môi trường lỏng để nuôi nấm tách DNA
Thành phần Khối lượng cho 1L
D-glucose 10 g
KNO3 3 g
KH2PO4 2g
Chiết xuất nấm men 2 g