3.1.2.Kết quả phân lập nấm đạo ônM oryzaegây bệnh trên lúa
3.2. Kết quả tách chiếtDNAvà kiểm định các chủngnấm đạo ônM oryzae đã phân
phân lập bằng chỉ thị phân tử
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA của các chủng phân lập
DNA của tất cả các chủng nấmsau khi phân lập được tách chiết sử dụng phương pháp phân giải tế bào bằng enzyme Extralyse. Sau khi chuyển vào ống effendorf chứa mơi trường lỏng có bổ sung kháng sinh khoảng 4 ngày, sợi nấmtiếp
dạng di truyền của quần thể nấm đạo ôn nghiên cứu, mức độ nguyên vẹn của DNA khuôn dùng cho phản ứng PCR rất quan trọng. Sự đứt gãy DNA khn có thể gây ra hiện tượng đa hình giả, dẫn đến sự sai lệch trong kết quả phân tích đa dạng di truyền. Do vậy, DNA sau khi tách chiết được điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.4), quan sát các vạch băng để kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA.
Hình ảnh điện di cho thấy các mẫu DNA cho một băng sáng rất rõ nét, gọn, khơng đứt gãy hay lẫn tạp trong q trình tách chiết. Đây là nguyên liệu tốt cho các phản ứng PCR trong bước nghiên cứu tiếp theo (Hình 3.4).
Hình 3.4.Kết quả điện diDNA tổng số của một số chủng nấm đạo ôn
L: thang DNA 1kb, 1-13: các chủng phân lập
Để các phản ứng PCR được tối ưu và chính xác, các mẫu DNA cần đảm bảo đủ nồng độ và độ tinh sạch. Song song với việc đánh giá chất lượng của sản phẩm tách chiết, DNA tổng số còn được đo nồng độ bằng phương pháp đo quang phổ trên máy đo Nanodrop. Kết quả đo Nanodrop mẫu DNA từ các chủng nấm phân lập được thể hiện ở Phụ lục 1.
Kết quả Phụ lục 1 cho thấy nồng độ DNA của các mẫu dao động từ 33,3- 1432 ng/µl đảm bảo đủ hàm lượng DNA phục vụ cho phản ứng PCR. Bên cạnh đó, các mẫu DNA tách chiết cho chỉ số OD260/280 = 1,71-2,16, trong đó chỉ có 4 mẫu có OD < 1,8 là I42 (1,73), I44 (1,78), I53 (1,78) và I85 (1,71). Điều đó cho thấy, các mẫu DNA tách chiết đều đạt yêu cầu về chất lượng, đảm bảo đủ độ tinh sạch cho chạy phản ứng PCR.
Tất cả 114 chủng phân lập đã được tách chiết DNA với chất lượng và độ tinh sạch đạt tiêu chuẩn cho chạy phản ứng PCR.
3.2.2. Kết quảkiểm định các chủng phân lập bằng chỉ thị phân tử
Sau khi thu được mẫu DNA từ các chủng phân lập đảm bảo chất lượng về nồng độ và độ tinh sạch, tiến hành chạy PCR với cặp mồi đối chứng dương ITS5/ITS4 để kiểm tra. Các mẫu DNA được pha loãng về cùng nồng độ 20ng/µl. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, kết quả được thể hiện trong Hình 3.5.
Hình 3.5. Kết quả PCR một sốchủng phân lập bằng cặp mồi ITS5/ITS4
L: thang DNA 1kb, “+”: chủng đối chứng dương FRD127, “-”:H2O, 1-12: các mẫu nấm đã phân lập
Kết quả PCR kiểm tra trên mẫu DNA tách chiết từ các chủng phân lập cho thấy, tất cả các chủng phân lập đượcđều là nấm đạo ôn với vạch băng đặc trưng cho nấm M. oryzaeở vị trí khoảng 550 bp tương đương với kích thước băng xuất hiện
trên giếng của mẫu đối chứng dương FRD127. Trong khi mẫu đối chứng âm (nước) khơng có sự xuất hiện của băng DNA. Điều nàychứng tỏ tất cả các chủng nấm đã được phân lập thành công từ nấm bệnh đạo ônM. oryzae. DNA của các chủng M. oryzae được dùng làm vật liệu để phân tích kiểu gen (genotyping) với 13 chỉ thị SSR sử dụng Qiagen microsatellite PCR kit.
Như vậy, kiểm định bằng chỉ thị ITS5/ITS4 khẳng định được 114 chủng phân lập chính xác là nấm đạo ôn M.oryzae. Trong phạm vi của đề tài luận văn, từ 114
chủng phân lập, 58 chủng được chọn, gồm10 chủng thu từ miền Trung, 17 chủng thu tại đồng bằng sông Hồng và 31 chủng thu tại khu vực trung du miền núi phía Bắc, để phân tích sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm đạo ôn. Các phản ứng khuếch đại PCR với các cặp mồi SSR được thực hiện tại Phịng thí nghiệm
LMI RICE-2, sau đó các đĩa sản phẩm PCR sẽ được gửi đến đơn vị BGPI (CIRAD Pháp) để giải trình tự.