Chương 2 .VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Các phương pháp được nghiên cứu
2.4.2.2. Phương pháp PCR
DNA sau khi tách được pha loãng ở nồng độ 20 ng để sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR. Trước tiên, mẫu được phân tích bằng cặp mồi đối chứng dương (ITS5/ITS4) nhằm đảm bảo đúng DNA được phân lập từ nấm M. oryzae. Do vùng ITS (Internal Transcribes Spacer) có đặc điểm vừa có trình tự bảo thủ, vừa có
thậm chí giữa các chủng trong cùng một lồi.Cặp mồi đối chứng dương ITS5/ITS4 được dùng để phân biệt giữa nấm đạo ôn và các loại nấm khác nhờ vào đoạn trình tự được khếch đại có kích thước khác nhau. Cụ thể, đối với nấm đạo ơn, kích thước đoạn trình tự được khếch đại là 550bp và đối với các loại nấm khác kích thước này dao động trong khoảng 500-700bp. Chủng nấm đối chứng dương FRD127 đã được phân lập từ nấm đạo ôn và được tách chiết DNA đảm bảo chất lượng cho phản ứng PCR. Đối chứng này được cung cấp bởi phía đơn vị hợp tác là trung tâm BGPI (Pháp).Sản phẩm PCR được đánh giá bằng điện di trên gel agarose 1%.
Bước tiếp theo, các mẫu DNA được chạy multi-PCRvới 13 cặp mồi SSR có gắn các tín hiệu huỳnh quang[10]. Sự khếch đại gen các chủng nấm đạo ôn với các cặp mồi SSR sẽ được thực hiện trong phịng thí nghiệm LMIRICE-2, sau đó các đĩa sản phẩm PCR sẽ được gửi đến BGPI (Pháp) để giải trình tự. Thơng tin về các chỉ thị phân tử được trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Danh sách các cặp mồi SSR được sử dụng trong nghiên cứu
STT
Tín hiệu huỳnh quang
Mồi xi Trình tự mồi xi Mồi ngược Trình tự mồi ngược
Kích thước khuếch đại (bp)
1 ITS5 ITS4 550
2 Ned Pyrms43B GGGAATCTTGGCCATTAACC Pyrms44 CTTGATTGGTGGTGGTGTTG 384
3 Ned Pyrms63 TTGGGATCTTCGGTAAGACG Pyrms64 GCCGACAAGACACTGAATGA 149-177
4 Ned Pyrms37 ACCCTACCCCCACTCATTTC Pyrms38 AGGATCAGCCAATGCCAAGT 188-278
5 Ned Pyrms319 TAAGACCACTGGCGGAATCT Pyrms320 GGCTTTGTCTGGTTGTACGG 283-292
6 Vic Pyrms657 ATCAGTCGAACCCACAAAGC Pyrms658 ATGTGTGGACGAACCAGTCC 161-171
7 Vic Pyrms427 CTGTCACCACAACCAAGACG Pyrms428 TTGCCCTGATTTGTCAGTCA 196-242
8 Vic Pyrms607 CCCAAGCTCCATAATACGCTAC Pyrms608 TCCGAGACTCTTTGGATAGCAC 271-302
9 Fam Pyrms409 TCCCAGTACTTGCCCATCTC Pyrms410B CTCCGATTCATGGCACACAC 311
10 Fam Pyrms233 TGAGATGGACCGCATGATTA Pyrms234 TTGATGGCAGAGACATGAGC 239-283
11 Fam Pyrms47 TCACATTTGCTTGCTGGAGT Pyrms48 AGACAGGGTTGACGGCTAAA 156-195
12 Pet Pyrms77B AGGCTCTCTGCCTACGAAGT Pyrms78 GCTTTCGGCAAGCCTAATC 220
13 Pet Pyrms83 GTCTGCCTCGACTCCTTCAC Pyrms84B GCAAAGTTGTTTGAGCAAGG 112
Thao tác tiến hành:
- Bước 1: Pha thành phần phản ứng PCR, sử dụng Qiagen microsatellite PCR kit (Bảng 2.4). Bảng 2.4. Thành phần của một phản ứng PCR 5 µl Thành phần Thể tích Master mix 2,5 µl H2O 0,75 µl Q-solution 0,5 µl DNA (20 ng) 0,75 µl Primer mix (2 µM) 0,5 µl
- Bước 2: Khuếch đại PCR theo chu kì nhiệt như sau: Biến tính tách mạch đơi DNA ở 95o
C–15 phút Khuếch đại DNA 40 chu kỳ:
Biến tính tách mạch: 94oC–30 giây Gắn mồi ở 55o C–90 giây Kéo dài mạch ở 72oC–1 phút Hồn tất chu trình ở 60o C–30 phút
Trong phản ứng PCR, việc lựa chọn chiều dài mồi và nhiệt độ gắn mồi có vai trị quan trọng, ở bước phân tích này, chúng tơi lựa chọn nhiệt độ gắn mồi 55oC là tối ưu nhất. Sau khi kiểm tra bằng điện di thì khơng có sự đa hình ở các mẫu.
- Bước 3: Sản phẩm PCR được gửi sang Đơn vị nghiên cứu BGPI (CIRAD) để giải trình tự bằng máy Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer.