3.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh và phân lập nấm đạo ôn M.oryzae gây bệnh trên lúa
3.1.1. Kết quả thu thập mẫu lúa bị bệnh đạo ôn
Trong vụ đông xuân 2018, đã tiến hành thu mẫu tại cả 3 vùng, đây là mùa vụ bệnh đạo ôn phát triển mạnh và gây thiệt hại nặng. Tuy nhiên, do các giống lúa địa phương hiện nay chủ yếu được trồng vào vụ hè thu, tập trung tại các tỉnh thuộc khu vực miền núi phía Bắc cho nên vào thời điểm giữa tháng 9 năm 2018 nhóm nghiên cứu đã tổ chức thu mẫu thêm tại khu vực này. Kết quả thu thập mẫu bệnh đạo ơn được trình bày trong Bảng 3.1.
Tổng số mẫu đã thu thập được là 117 mẫu, trong đó 54 mẫu được thu ở 14 tỉnh miền núi phía Bắc, 26 mẫu được thu tại 8 tỉnh thuộc vùng đồng bằng sông Hồng và 37 mẫu thu được ở 13 tỉnh miền Trung. Như vậy, tổng số mẫu bệnh thu được ở miền Bắc là 80 mẫu, tương đương 68,4%, ở miền Trung là 37 mẫu, chiếm 31,6%. Ở mỗi tỉnh số mẫu thu được dao động từ 1 đến 7, một số tỉnh như Ninh Bình, Vĩnh Phúc và Đắc Lắc chỉ thu được 1 mẫu bệnh, riêng Điện Biên và Yên Bái đã thu được 7 mẫu.
Trong số 117 mẫu thu được, có 84 mẫu bệnh (chiếm 71,8%) từ giống lúa thương mại, 19 mẫu (chiếm 16,2%) trên giống lúa địa phương được trồng chủ yếu tại khu vực miền núi phía Bắc, cịn lại 14 mẫu bệnh không xác định được tên giốngchiếm 12%. Khang dân, Bắc thơm số 7 và BC15 được đánh giá là các giống lúa thương mại có diện tích canh tác lớn, mẫn cảm với bệnh đạo ôn, do vậy số lượng mẫu thu từ các giống này nhiều hơn các giống khác ở cả miền Bắc và miền Trung. Cụ thể, đã thu được 18 mẫu bệnh từ giống Khang dân, 9 mẫu từ giống BC15 và 9 mẫu từ Bắc thơm số 7.
Bảng 3.1. Danh sách các mẫu bệnh được thu thập trong nghiên cứu STT Tên STT Tên
mẫu/chủng
Nơi thu thập Tên giống Vị trí vết bệnh
Phân lập bào tử Tỉnh Huyện
1 I1 Điện Biên Mường tra IR64 Cổ bông +
2 I2 Điện Biên Tuần Giáo IR64 Cổ bông +
3 I3 Điện Biên Điện Biên Đông Bắc thơm Cổ bông +
4 I4 Điện Biên Điện Biên Đông Bắc thơm Cổ bông +
5 I5 Điện Biên Điện Biên Đông Bắc thơm Cổ bông +
6 I6 Điện Biên Điện Biên Đông Nếp Cổ bông +
7 I7 Điện Biên Mường tra Bắc thơm Cổ bông +
8 I8 Hịa Bình Kỳ Sơn Khang dân Cổ bơng +
9 I9 Hịa Bình Kỳ Sơn Khang dân Cổ bông +
10 I10 Hịa Bình Hịa bình Khang dân Cổ bông +
11 I11 Lai Châu Tam Đường Bắc thơm Cổ bông +
12 I12 Lai Châu Xìn hồ IR64 Cổ bơng +
13 I13 Lai Châu Phong Thổ Tẻ Râu cổ bông +
14 I14 Lai Châu Tam Đường - Cổ bông +
15 I15 Lào Cai Sa Pa Nếp Pờ lè Cổ bông +
16 I16 Lào Cai Bắc Hà Ma làng Lá +
17 I17 Lào Cai Bắc Hà Nếp nương Cổ bông +
18 I18 Lào Cai Bắc Hà Bản Liền Cổ bông +
19 I19 Sơn La Sơn La Nếp pổm Cổ bông +
20 I20 Sơn La Sơn La Nếp tan Cổ bông +
21 I21 Sơn La Sơn La Nếp pổm Lá +
22 I22 Sơn La Chiêng xom Cổ bông +
23 I23 Yên Bái Tú Lệ Nếp Tú Lệ Cổ bông +
24 I24 Yên Bái Tú Lệ Nếp Tú Lệ Cổ bông +
25 I25 Yên Bái Tú Lệ HT1 Cổ bông +
26 I26 Yên Bái Tú Lệ Tẻ Đỏ Cổ bông +
27 I27 Yên Bái Tú Lệ Chiêm Hương Cổ bông +
28 I28 Yên Bái Tú Lệ Nếp 97 Cổ bông +
29 I29 Yên Bái Tú Lệ Nếp Tú Lệ Cổ bông +
30 I30 Bắc Giang Bắc Giang Khang dân Cổ bông +
31 I31 Bắc Giang Việt Yên - Lá +
32 I32 Bắc Giang Hiệp Hòa Nếp cái hoa vàng Cổ bông x
33 I33 Bắc Kạn Chợ Mới Đoàn Kết Cổ bông +
34 I34 Bắc Kạn TX Bắc Kạn Nếp Vải Cổ bông +
35 I35 Bắc Kạn Bạch Thông Nếp Lào Lá +
36 I36 Bắc Kạn Ngân Sơn Nếp 97 Lá x
37 I37 Cao Bằng Hịa An Khẩu lai Cổ bơng +
38 I38 Hà Giang Bắc Quang Hương Biển 3 Cổ bông +
39 I39 Hà Giang Bắc Quang Nếp 97 Cổ bông +
40 I40 Hà Giang Vị Xuyên Thiên ưu 8 Cổ bông +
41 I41 Hà Giang Vị Xuyên TBR225 Cổ bông +
42 I42 Phú Thọ Tam nông Khang dân Cổ bông +
43 I43 Phú Thọ Thanh Thủy Nhị Ưu Cổ bông +
44 I44 Phú Thọ Thanh Sơn Khang dân Cổ bông +
45 I45 Phú Thọ Yên Lập Nếp gà gáy Lá x
Bảng 3.1. Danh sách các mẫu bệnh được thu thập trong nghiên cứu STT Tên
mẫu/chủng
Nơi thu thập Tên giống Vị trí vết bệnh
Phân lập bào tử Tỉnh Huyện
48 I48 Quảng Ninh Tx. Chí Linh Hương thơm Lá +
49 I49 Thái Nguyên Đại Từ BT-E Cổ bông +
50 I50 Thái Nguyên Phú Bình Nếp Thầu Rầu Lá +
51 I51 Thái Nguyên Phú Bình Nếp cái hoa vàng Lá +
52 I52 Tuyên Quang Tuyên Quang Trung trang Cổ bông +
53 I53 Tuyên Quang Sơn Dương BC15 Cổ bông +
54 I54 Tuyên Quang Hàm Yên Nhị ưu 838 Cổ bông +
55 I55 Bắc Ninh Quế Võ TBR225 Lá +
56 I56 Bắc Ninh Quế Võ Khang dân 18 Lá +
57 I57 Bắc Ninh Tiên Du - Cổ bông +
58 I58 Bắc Ninh Tiên Du TBR225 Cổ bông +
59 I59 Hà Nam Duy Tiên - Cổ bông +
60 I60 Hà Nam Duy Tiên T10 Cổ bông +
61 I61 Hà Nam Bình Lục Tám thơm Cổ bông +
62 I62 Hà Nam Bình Lục Khang dân Cổ bơng +
63 I63 Hà Nội Quốc Oai Bắc thơm Cổ bông +
64 I64 Hà Nội Thanh Trì Q5 Cổ bông +
65 I65 Hà Nội Thạch Thất BC15 Cổ bông +
66 I66 Hà Nội Quốc Oai BC15 Cổ bông +
67 I67 Hải Dương Vĩnh Bảo BC15 Cổ bông +
68 I68 Hải Dương Tứ Kỳ Khang dân Cổ bông +
69 I69 Hải Dương Tứ Kỳ BC15 Cổ bông +
70 I70 Hải Dương Vĩnh Bảo BC15 Cổ bông +
71 I71 Nam Định Hải Hậu Tám thơm Cổ bông +
72 I72 Nam Định Trực Ninh Tạp giao Cổ bông +
73 I73 Nam Định Nam Định Bắc thơm Cổ bông +
74 I74 Nam Định Ý Yên Ai32 Cổ bông +
75 I75 Ninh Bình Hoa Lư Thục hưng Cổ bông +
76 I76 Thái Bình Qùynh Phụ BC15 Cổ bơng +
77 I77 Thái Bình Vũ Thư BC15 Cổ bông +
78 I78 Thái Bình Đơng Mỹ BC15 Cổ bơng +
79 I79 Thái Bình Hưng Hà Khang dân Cổ bông +
80 I80 Vĩnh Phúc Yên lạc Bắc thơm Cổ bông +
81 I81 Thanh Hóa Quảng Xương Khang dân Cổ bơng +
82 I82 Thanh Hóa Tĩnh Gia Thiên Ưu 8 Lá +
83 I83 Thanh Hóa Tp. Thanh Hóa Thái xuyên 11 Lá +
84 I84 Thanh Hóa Tp. Thanh Hóa Nếp thơm Lá +
85 I85 Nghệ An Diễn Châu Khang dân Cổ bông +
86 I86 Nghệ An Diễn Châu X3 Cổ bông +
87 I87 Nghệ An Quỳnh Lưu Nhị Hương Cổ bông +
88 I88 Hà Tĩnh Can Lộc BE1 Cổ bông +
89 I89 Hà Tĩnh Thạch Hà Tám thơm Lá +
90 I90 Hà Tĩnh TX. Hồng Lĩnh NX30 Cổ bông +
91 I91 Quảng Bình Minh Hịa Khang dân Cổ bơng +
92 I92 Quảng Bình Minh Hịa Bắc thơm Cổ bơng +
Bảng 3.1. Danh sách các mẫu bệnh được thu thập trong nghiên cứu STT Tên
mẫu/chủng
Nơi thu thập Tên giống Vị trí vết bệnh
Phân lập bào tử Tỉnh Huyện
95 I95 Quảng Trị Triệu Phong Bắc thơm Cổ bông +
96 I96 Quảng Trị Vĩnh Linh Khang dân Cổ bông +
97 I97 Huế Tx. Hương Trà Khang Dân Cổ bông +
98 I98 Huế Tx. Hương Trà ML48 Cổ bông +
99 I99 Huế Tx. Hương Trà HT1 Cổ bông +
100 I100 Huế Tx. Hương Trà Khang Dân Cổ bông +
101 I101 Quảng Nam Duy Xuyên Thiên ưu Cổ bông +
102 I102 Quảng Nam Quế Sơn HT1 Cổ bông +
103 I103 Quảng Ngãi Tung Hia HT1 Cổ bông +
104 I104 Quảng Ngãi Bình Sơn XII30 Cổ bơng +
105 I105 Quảng Ngãi Bình Sơn HT1 Cổ bông +
106 I106 Kon Tum Vinh Quang Nàng Hương Cổ bông +
107 I107 Kon Tum Vinh Quang - Cổ bông +
108 I108 Kon Tum Vinh Quang - Cổ bơng +
109 I109 Bình Định Hồi Nhơn BTR1 Lá, cổ
bơng
+
110 I110 Bình Định Phú Mỹ Khang Dân 18 Cổ bông +
111 I111 Bình Định An Nhơn DV8 Cổ bông +
112 I112 Gia Lai TP. Pleiku - Lá, cổ
bông
+
113 I113 Gia Lai Chu Pah - Cổ bông +
114 I114 Gia Lai Chu Pah - Cổ bông +
115 I115 Đắc Lắc M'Drak - Cổ bông +
116 I116 Khánh Hòa Tuy An - Cổ bơng +
117 I117 Khánh Hịa Ninh Hịa - Lá, cổ
bơng
+
(ghi chú: “+”: nấm đạo ôn đã phân lập được, “x”: không phải là nấm đạo ôn)
Các mẫu bệnh thu được chủ yếu từ cổ bông với những triệu chứng rất phổ biến và điển hình, trong đó có 97 mẫu cổ bơng chiếm 82,9% trên tổng số mẫu thu thập và 20 mẫu lá, tương đương 17,1%. Một số hình ảnh của quá trình thu thập mẫu bệnh được thể hiện ở Hình 3.1.
Hình 3.1.Quá trình thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng
A,B,C: mẫu đạo ơn cổ bơng, lá, cổ lá,D: nhóm thu mẫu trên đồng ruộng,E: cánh đồng lúa nhiễm đạo ôn nặng
Kết quả thu thập mẫu lúa bị bệnh đạo ôn cho thấy trong vụ đông xuân và hè thu 2018, dịch bệnh đạo ôn gây hại tại nhiều tỉnh thành của miền Bắc và miền Trung. Bệnh bùng phát mạnh trong vụ đông xuân tại các tỉnh thuộc vùng đồng bằng sông Hồng và các tỉnh miền Trung từ Huế trở ra. Tại các tỉnh từ Đà Nẵng đến Đắc Lắc, do khí hậu khơ nóng, bệnh đạo ơn ít phát triển.
Như vậy,tổng 117 mẫu bệnhđã đượcthu thập, rải rác tại các tỉnh thuộc ba vùng sinh thái, gồm miền Trung, đồng bằng sơng Hồng và khu vực miền núi phía Bắc. Thu thập thành công các mẫu bệnh từ cả hai nhóm giống: giống lúa thương mại và giống lúa địa phương, trong đó, chủ yếu là các mẫu bệnh đạo ôn cổ bông.
3.1.2.Kết quả phân lập nấm đạo ôn M.oryzaegây bệnh trên lúa
Sau khi thu thập mẫu bệnh, vết bệnh được làm ẩm qua đêm đểbào tử nấm phát triển rồi tiến hành phân lập bào tử đơn trên kính hiển vi. Từ mỗi mẫu bệnh phân lập lấy một bào tử đơn, mỗi bào tử đơn là một chủng phân lập (isolate). Kết
quả, từ tổng số 117 mẫu lúathu thập đã phân lập được 114 chủng nấm đạo ơn. Có 3 mẫu được xác định không phải nấm đạo ôn. Danh sách các chủng nấm đã phân lập được trình bày trong Bảng 3.1và một số hình ảnh trong quá trình phân lập được thể hiện trên Hình 3.2.
Hình 3.2.Q trình ni cấy mẫu bệnh cho hình thành bào tử nấm
A,B: nuôi mẫu bệnh đạo ôn cổ bông,lá: C: phân lập bào tử nấm dưới kính hiển vi, D: lớp bào tử nấm đạo ôn phát triển trên mẫu cổ bông sau 24h, E: lớp bào tử nấm
đạo ôn phát triển trên mẫu lá sau 24h, F: cụm và cành bào tử nấm đạo ơn
Quan sát hình thái bào tử nấm dưới kính hiển vi cho thấy,ngồi những bào tử có dạng búp sen hoặc quả lê đặc trưng của nấm đạo ơn, cịn có sự hiện diện của một số loại nấm khác. Dựa trên đặc điểm này, các bào tử nấm đạo ôn được phân lập và phân biệt với các loại nấm khác. Sự nhầm lẫn có thể xảy ra trong q trình thu thập mẫu do một số nấm gây bệnh khác cũng gây ra triệu chứng rất giống với vết bệnh đạo ôn như Curvularia luneta và Bipolaris oryzae. Ba mẫu được xác định không
mẫu trên cổ bông I32 thu được ở Bắc Giang. Một số hình ảnh của quá trình phân lập bào tử đơn được thể hiện trong Hình 3.3.
Hình 3.3.Quá trình phân lập bào tử đơn và nuôi cấy
A: các bào tử nấm được trải lên trên môi trường agar, B: bào tử đơn phát triển sau 24h, C: bào tử đơn phát triển trên môi trường bột gạo sau 7 ngày, D: chủng nấm
nuôi trên giấy thấm để bảo quản và nuôi trong môi trường lỏng cho tách chiết DNA, E: mẫu nấm được làm khô trước khi bảo quản
Trên tổng số 117 mẫu bệnh thu thập, đã phân lập được 114 chủng nấm đạo ôn, loại bỏ 3 mẫu bệnh không phải nấm M. oryzae.
3.2. Kết quả tách chiếtDNAvà kiểm định các chủngnấm đạo ônM. oryzae đã phân lập bằng chỉ thị phân tử phân lập bằng chỉ thị phân tử
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA của các chủng phân lập
DNA của tất cả các chủng nấmsau khi phân lập được tách chiết sử dụng phương pháp phân giải tế bào bằng enzyme Extralyse. Sau khi chuyển vào ống effendorf chứa mơi trường lỏng có bổ sung kháng sinh khoảng 4 ngày, sợi nấmtiếp
dạng di truyền của quần thể nấm đạo ôn nghiên cứu, mức độ nguyên vẹn của DNA khuôn dùng cho phản ứng PCR rất quan trọng. Sự đứt gãy DNA khn có thể gây ra hiện tượng đa hình giả, dẫn đến sự sai lệch trong kết quả phân tích đa dạng di truyền. Do vậy, DNA sau khi tách chiết được điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.4), quan sát các vạch băng để kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA.
Hình ảnh điện di cho thấy các mẫu DNA cho một băng sáng rất rõ nét, gọn, khơng đứt gãy hay lẫn tạp trong q trình tách chiết. Đây là nguyên liệu tốt cho các phản ứng PCR trong bước nghiên cứu tiếp theo (Hình 3.4).
Hình 3.4.Kết quả điện diDNA tổng số của một số chủng nấm đạo ôn
L: thang DNA 1kb, 1-13: các chủng phân lập
Để các phản ứng PCR được tối ưu và chính xác, các mẫu DNA cần đảm bảo đủ nồng độ và độ tinh sạch. Song song với việc đánh giá chất lượng của sản phẩm tách chiết, DNA tổng số còn được đo nồng độ bằng phương pháp đo quang phổ trên máy đo Nanodrop. Kết quả đo Nanodrop mẫu DNA từ các chủng nấm phân lập được thể hiện ở Phụ lục 1.
Kết quả Phụ lục 1 cho thấy nồng độ DNA của các mẫu dao động từ 33,3- 1432 ng/µl đảm bảo đủ hàm lượng DNA phục vụ cho phản ứng PCR. Bên cạnh đó, các mẫu DNA tách chiết cho chỉ số OD260/280 = 1,71-2,16, trong đó chỉ có 4 mẫu có OD < 1,8 là I42 (1,73), I44 (1,78), I53 (1,78) và I85 (1,71). Điều đó cho thấy, các mẫu DNA tách chiết đều đạt yêu cầu về chất lượng, đảm bảo đủ độ tinh sạch cho chạy phản ứng PCR.
Tất cả 114 chủng phân lập đã được tách chiết DNA với chất lượng và độ tinh sạch đạt tiêu chuẩn cho chạy phản ứng PCR.
3.2.2. Kết quảkiểm định các chủng phân lập bằng chỉ thị phân tử
Sau khi thu được mẫu DNA từ các chủng phân lập đảm bảo chất lượng về nồng độ và độ tinh sạch, tiến hành chạy PCR với cặp mồi đối chứng dương ITS5/ITS4 để kiểm tra. Các mẫu DNA được pha loãng về cùng nồng độ 20ng/µl. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, kết quả được thể hiện trong Hình 3.5.
Hình 3.5. Kết quả PCR một sốchủng phân lập bằng cặp mồi ITS5/ITS4
L: thang DNA 1kb, “+”: chủng đối chứng dương FRD127, “-”:H2O, 1-12: các mẫu nấm đã phân lập
Kết quả PCR kiểm tra trên mẫu DNA tách chiết từ các chủng phân lập cho thấy, tất cả các chủng phân lập đượcđều là nấm đạo ôn với vạch băng đặc trưng cho nấm M. oryzaeở vị trí khoảng 550 bp tương đương với kích thước băng xuất hiện
trên giếng của mẫu đối chứng dương FRD127. Trong khi mẫu đối chứng âm (nước) khơng có sự xuất hiện của băng DNA. Điều nàychứng tỏ tất cả các chủng nấm đã được phân lập thành công từ nấm bệnh đạo ônM. oryzae. DNA của các chủng M. oryzae được dùng làm vật liệu để phân tích kiểu gen (genotyping) với 13 chỉ thị